动物细胞体外培养知识PPT.pptVIP

动物细胞体外培养基础知识;基础知识要点;一、基本概念;二、基本条件;细胞培养基介绍;四、设施设备及培养器皿;五、细胞传代的准备工作;六、细胞培养的基本操作;2、细胞复苏操作 （1）登记要取用的细胞。 （2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解。 （3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合适的离心强度。 （4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新鲜培养基重悬后置于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除DMSO。 （5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。;3、细胞传代操作 （1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品放入超净台进行操作。 （2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。 （3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新鲜培养基进行传代，记录代次。 （4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。;4、生物反应器培养细胞的基本操作流程 （1）反应罐安装、调试电极、管路连接。 （2）反应罐洗刷、灭菌。 （3）检查灭菌管路、连接电极线。 （4）通过取样口抽出罐内灭菌水。 （5）将补料、收料容器连接到反应罐上，接种细胞到罐内。 （6）设定T、DO、STIRR、pH，调节通气管路。 （7）根据实验设计，进行取样，监控密度、活度、葡萄糖等指标，记录参数变化，适时进行补料、收料无菌操作。;5、大规模细胞培养方式简介： （1）分批式培养：该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。 ;（2）流加式培养：是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。;（3）半连续式培养：又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。;（4）连续式培养：是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。 ;（5）灌流式培养：是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。 ;七、细胞库;主细胞库：取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，供建立工作细胞库用。 工作细胞库：由MCB细胞传代扩增达到一定传代水平的细胞，合并后制成一批均质的细胞悬液，定量分装。 细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、外源因子和内源因子的检测、致瘤性检测等。;八、需要解决问题及实验方法;九、需要注意的问题; 谢 谢