分子生物学基因诊断.pptx

基因治疗的概念 将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。基因治疗分类体细胞(somatic cell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代 内容提要第一节 基因治疗的策略第二节 基因转移技术第三节 基因干预第四节 治疗基因的受控表达第五节 基因治疗的应用研究第六节 基因治疗的问题与展望 第一节 基因治疗的策略一、基因置换二、基因添加三、基因干预四、自杀基因治疗五、基因免疫治疗 一、基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，导入的正常基因，以置换基因组内原有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行校正。 特点：对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。 基因同源重组技术定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting）基因同源重组技术染色体重组载体校正后的染色体二、基因添加 (gene augmentation)定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。类型：在基因缺陷的细胞中导入相应的正常基因，补偿缺陷基因的功能，细胞内的缺陷基因并未除去；向靶细胞中导入其本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。三、基因干预（gene interference）定义：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使 之不能表达，以达到治疗疾病的目的。 例如反义核酸、核酶或干扰RNA技术等。四、自杀基因治疗 原理：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。 为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 自杀基因的作用机制（一）自杀基因系统TK/GCV：单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。CD/5-FC：大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。（二）旁观者效应 旁观者效应(bystander effect)：“自杀基因”导入后，不仅使导入了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻或远处的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。 明显增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用。五、基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 第二节 基因转移技术 一、病毒介导的基因转移系统二、非病毒介导的基因转移系统根据基因转移的途径不同，基因治疗分为：1. ex vivo（经活体） 是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。2. in vivo（活体内） 是指将目的基因直接应用于患者体内。载体目的基因基因转移的两种途径将目的基因导入患者靶细胞,体外培养靶细胞ex vivoin vivo将重组靶细胞回输体内将目的基因直接输入体内 一、病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。膜蛋白核心蛋白逆转录酶+ssRNA（一）逆转录病毒（Retrovirus）载体人类免疫缺陷病毒 （HIV） 逆转录病毒的生活周期 1. 逆转录病毒前病毒的结构特点两端各有一长末端重复序列LTR。 LTR由U3、R和U5三部分组成，内含增强子、启动子、poly(A)加尾信号及病毒整合序列(IS) 。病毒有三个结构基因： gag、pol和env基因（编码包装蛋白）。5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ） 等。 LTR therapeutic gene LTR2. 逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒载体 保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。gag pol env 2. 逆转录病毒介导的基因转移系统辅助细胞株 它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成。该细