第16章细胞因子及其受体检测(免疫学)PPT.ppt

指示细胞 Wish（羊膜上皮细胞），人IFN测定 Hep-2(喉癌的上皮细胞)、人IFN测定 L929（小鼠成纤维细胞），检测小鼠IFN 病毒 水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV) 鼠脑心肌炎病毒（EMCV） （二）指示细胞和病毒 （三）技术要点 细胞的复苏和VSV的准备 细胞培养（细胞对照、病毒对照） 细胞病变程度的观察 IFN活性的计算 四、趋化活性测定法 用于趋化性细胞因子的测定 常用Boyden 小室法 Boyden Chamber Shi et al. J Immunol Methods. 1993，164:149 （一）原理 （二）技术要点 准备指示细胞 加样 孵育 观察结果 结果计算 滤膜：计数受趋化细胞 趋化因子 细胞 趋化试验原理示意 五、生物学检测法的评价 （一） 优点 1．检测细胞因子的生物学活性。 2．灵敏度较高。 （二）缺点 1. 特异性不强。 2. 操作繁琐，实验周期长。 3. 影响因素较多，重复性较差，特别是批间差异大。 第二节 免疫学检测法 一、体液中细胞因子检测 双抗体夹心ELISA 放射免疫分析法 抗体芯片 酶联免疫斑点实验(ELISPOT) 二、细胞内细胞因子的检测 三、免疫学检测法的评价 ELISPOT检测细胞因子 Analysis of intracellular cytokines PBMC PMA ionomycin PBMC Monensin FCM analysis incubate PBMC incubate fixed by paraform Add saponin Th1: secrete IL-2, IFN-r mainly Th2: secrete IL-4, IL-5 mainly Labeled anti-cytokine 刺激剂 阻断剂 透膜剂 Anti－IFN-r－PE Anti－IL-4－FITC 免疫学检测法的评价 （一）优点 1．? 特异性高。 2．? 操作方法简便，时间短。 3．? 重复性好。 （二）缺点 1．检测细胞因子的蛋白含量。 2．敏感度不如生物学测定法。 第三节 分子生物学检测 一、DNA水平的检测 （一）Southern印迹杂交：不常用、DNA/DNA （二）PCR和原位PCR （三）荧光定量PCR （四）DNA序列测定 二、mRNA表达水平的测定 1、Northern blot 2、原位杂交 3、Real time-PCR Determination of cytokines by RT-PCR 细胞因子及其受体检测 Assay for Cytokine and Cytokine Receptor INTRODUCTION What are cytokines? Kinds of cytokines Cytokine -mediated effects Cytokine receptor families Why do we detect cytokines? Methods for cytokines analysis What are cytokines? 由非神经—内分泌细胞产生的一大类与免疫应答活动密切相关的低分子蛋白与多肽。 A collection of polypeptides used for communications between cells Play role similar to hormones －Hormones usually act at a distance －Cytokines act locally Differ from growth factors that are produced constitutively, while cytokine production is carefully regulated Play an important role in both innate and adaptive immunity Kinds of Cytokines (structure and function) Interleukins (IL-1….35) Colony stimulating factors (M-CSF、G-CSF) Interferons (a, b, g) Tumor necrosis factors Chemokines (IL-8、GROs、MCP-1) Growth factors (EGF、FGF、IGF、PDGF) 1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性 2、多源与同源性 3、高效性 4、多效性（pleio