第6章基因工程上PPT.ppt

;第 6 章 ; 多聚酶链式反应 PCR Polymerase Chain Reaction;;PCR技术的创建;三篇重要论文;;;限制性内切酶裂解;;;;引物;94℃变性;;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);72℃;PCR技术的原理; 体外酶促合成特定DNA片段的一种方法。在存在DNA模板、引物、dNTP和适量缓冲溶液的反应混合物中，在高温DNA聚合酶的催化作用下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增，这种扩增是通过模板和DNA和引物之间的变性、复性、延伸三步反应为一周期循环进行。使目的DNA片段得以扩增，每一周期产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加。30个周期后，DNA片段在理论上可达到109倍。; ;加热;PCR扩增原理;双链DNA分子;双链断开;模板与引物结合;循环1;循环1;循环1;双链断开;模板与引物结合;循环2;94℃变性 双链断开;循环3;循环3;循环n;PCR原理;PCR product;PCR反应曲线;标准的PCR反应体系;PCR反应五要素;引物;引物设计的原则（一）;引物设计的原则（二）;引物设计的原则（三）;酶及其浓度;;dNTP 的质量与浓度;模板（靶基因，target gene）;模板（靶基因，target gene）;Mg2+浓度;PCR反应条件的选择;温度与时间的设置：;① 变性温度与时间：; ② 退火(复性)温度与时间：;引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：;③ 延伸温度与时间：;③ 延伸温度与时间：;循环次数;PCR反应特点;特异性强;PCR反应的特异性决定因素;灵敏度高;简便、快速;对标本的纯度要求低;1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究; ;2)反向PCR (reverse PCR) ;;3）多重PCR（复合PCR）;;4）LP-PCR（Labelled primers);;5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）;;6）PCR固相分析法;7）原位ＰＣＲ;操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物;8）ＲＴ－ＰＣＲ;9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 ;; 实时荧光定量PCR仪;PCR示例;1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂：10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1和引物2;1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL;2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/