第一周第一节PPT.ppt

免疫→标记技术测定;病从口入，严格把关！;;乙肝五项检测;经典标记技术;酶标记技术的催生;酶免疫技术原理及特点;;原理及特点;克隆酶供体免疫测定;主要内容;一、 酶标记技术;1. 标记酶的特点;2. 常用于酶免疫技术的酶;3 .酶和酶作用底物;3. 酶和酶作用底物;3.酶和酶作用底物;3. 酶和酶作用底物;1.3 酶和酶作用底物;底物的选择与使用;3 酶和酶作用底物;(二) 酶标记抗原或抗体;1.酶标记抗原或抗体条件;2. 酶标记抗原或抗体方法;3 .酶标记抗原或抗体纯化及鉴定;3 .酶标记抗原或抗体纯化及鉴定;4. 酶标记物保存;一、基本原理;二、方法类型及反应原理;（1）夹心法（sandwich ELISA）;;（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。 （3）加酶标抗体，洗涤。 （4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。 ;;2.双位点一步法检测抗原;; ; 如果待检标本中抗原浓度过高， 容易形成“钩状效应（hook effect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。;3.竞争法检测抗原;酶标抗原;（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。 （3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。; ;（二）检测抗体的方法; ; ;2.双抗原夹心法;;4.加酶作用的底物 不显色;3.竞争法检测抗体;（1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。 ③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;3.加酶作用的底物 显色;（2）竞争法检测HBeAb： ①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。 ②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。 ③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。 ④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;;4.捕获法;;5.加酶作用的底物 ??显色;方法评价;（图为瑞士HAMILTON FAME24/20全自动酶免分析仪）;（三）ELASA试剂;1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状。主要有微量反应板、小试管和小珠三种。 ;良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。 ;;将抗原或抗体固相化结合在固相载体上的过程称为包被（coating)。;2.2以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程： 　　抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶液稀释　→　 4oC过夜　→　用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。;3洗涤剂：去除游离的和结合的标记物，PBS或Tris-HCL缓冲液 终止液：硫酸或NaOH 4.对照和标准 ;棋盘滴定;（四）影响因素;（五）评价与临床应用