第八章+植物细胞培养及此生物质生产PPT.ppt

8.3.4.2 气动式生物反应器 原理：利用空气动力使培养液流动。 优点：剪切力小，对细胞伤害小。易长时间无菌培养。 缺点：低气速细胞容易聚集，与培养液混合差。高气速会产生泡沫，影响植物细胞生长。 第8章 植物细胞培养及次生物质生产 8.1 植物单细胞培养 8.2 植物细胞悬浮培养 8.3 植物细胞大规模培养及次生物质生产 植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的单个细胞或小细胞团，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 小规模的悬浮培养可在培养瓶中进行。大规模的需要利用生物反应器生产。 植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起来的。理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部能力（全能性）。 8.1 植物单细胞的培养 8.1.1 单细胞制备方法 8.1.2 单细胞培养技术 8.1.1 单细胞制备方法 机械法： 主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单体。如叶肉组织细胞的分离。 由于愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个细胞。 方法原始、效率低，细胞易破，获得细胞数量有限。但操作方便，且不会改变细胞的生理特性。 化学方法 草酸盐，秋水仙素，CH，2，4-D等对分散细胞有一定作用。 8.1.2 单细胞培养技术 8.1.2.1 平板培养法 是将悬浮培养的分散细胞均匀分布在一薄层固体培养基中进行培养的技术。具体步骤： 单细胞悬浮液的制备，并记数。 调节细胞密度。1×103 -1×105个/ml。 培养基选择与凝固剂选择，30-35℃混匀浇平板。密封后在倒置显微镜下标记单细胞位置。 25℃，暗培养。数天后计算植板率。 平板培养注意事项： 植板密度不能低于某一临界值（临界密度）； 添加有机成分或采用条件培养基，植板密度可以低一些。 应选用旺盛分裂期细胞； 操作时减少细胞损伤； 黑暗或弱光培养。 1×10 3 ~ 1×10 5个/ml。 临界密度：单细胞培养时，初始植板密度低于 某值，培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞 团，则该值就是临界密度。 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改 变，培养基越复杂则植板细胞的临界密度越 低，反之则相反。 8.1.2.2 看护培养 是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续生长和增殖的一种培养方法。这块愈伤组织被称为看护组织。 具体方法是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是简便、成功率高。 8.1.2.3 微室培养 是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。 微室培养要求： 微室要采用光学性能好的材料；材料能使小室与外界隔绝，且能保证适当的气体交换。 合适的培养基。能保证细胞生长和分裂。 选择合适的细胞。处于旺盛分裂期细胞，壁薄，透明度高。 主要指将植物细胞和小的细胞团悬浮于液体培养基中，在保持细胞良好分散状态下进行培养的技术。 细胞悬浮培养的优点是： 能大量提供分散性好且比较均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造条件。 细胞营养吸收充分、环境条件好，细胞增殖快。 可避免有害代谢物在局部浓度过高。 适合大规模的培养，生产有价值的活性代谢物。 8.2 植物细胞的悬浮培养 8.2.1 细胞悬浮培养一般过程 疏松易碎愈伤组织诱导：外植体，基本培养基及有机附加物（CH、谷氨酰胺等），植物生长物质（2，4-D和细胞分裂素）的种类、浓度和比例等，蔗糖浓度（10-30g/L）等均对疏松愈伤组织的形成有影响。 愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性。这样可获得大量均匀一致，疏松易碎，适合建立悬浮细胞系的愈伤组织。 单细胞分离及细胞悬浮培养: 选择合适的接种密度（104-105个/mL）、温度，摇床转速等。 愈伤组织形成和植株再生：悬浮细胞可直接形成肧状体或经愈伤组织分化成再生植株（快繁）。 如果以生产代谢产物为目的的细胞悬浮培养，则应采取适当措施分散开不断聚集的细胞团，使细胞保持继续增殖，达到最高细胞密度，收获目的产物。 8.2.2 细胞悬浮培养工艺 8.2.2.1 分批培养 指在培养过程中，一次性加入培养基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。即不向培养系统中补加培养基，也不从系统中排出培养物。 细胞生长呈现“S”形生长曲线。 悬浮细胞生长与增殖 延迟期，对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期、衰亡期。 8.2.2.2 连续培养 指在培养过程中，连续地以一定速度添加培养液，同时排出旧的培养液，使培养物不断得到营养物质补充并保持培养液总体积不变的培养。 封闭式连续培养：指新老培养液同时、等量流进、流出，回收细胞于培养系统中，