第四章 电泳法PPT.ppt

⑥ 扫描与分析 A.凝胶成像系统 B.迁移率的测定：迁移率的测定及计算方法。 根据各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)， 按下式计算相对迁移率mR: 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 相对迁移率mR= 2．不连续垂直柱状凝胶电泳  (1)装置 不连续柱凝胶电泳装置有三部分组成即，电泳槽，玻璃管和电泳仪。  ①电泳槽：电泳槽分为上下两层，其形状均为圆筒形。下层无特殊设备，上层底板中央装有铂金丝电极，在其周围以相等距离打10个小孔．在孔中插入玻璃管后，设法使溶液不发生渗漏现象。 ②玻璃管：一般内径5-7毫米，外径7-9毫米，长度10厘米左右，玻璃的性质均一，呈弱碱性，管口用金钢砂磨平，要切忌火烧，否则剥胶困难． ③电泳仪：它是一种恒压恒流的电源装置，其量程通常为600伏、100毫安。 第四节 琼脂糖电泳 琼脂糖电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持物的一种电泳方法。用琼脂糖胶分离双链DNA时，其迁移率大小，主要与样品的分子量有关，而与核酸的一级结构以及碱基的组成无关。琼脂糖电泳对于分离或分析天然DNA，包括不同形式的质粒DNA[即闭环DNA(cc-DNA)、开环DNA(oc-DNA)和线性DNA(1-DNA)]以及不同分子量的核酸片段都有效。? 基本原理 是电荷效应及分子筛效应(分离小分子物质时无此效应)。当琼脂糖介质的浓度较低时，胶的筛孔较大，适用于分离大分子(70bp以上)的核酸或蛋白质及其复合物。 [聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）] 二、操作 1.缓冲浓的配制 在配制缓冲液时，不论那一种都须加适量的EDTA，以便除去二价的金属离子。另外，硼酸与琼脂糖易形成复合物，因此一般Tris—硼酸缓冲液使用较少。 2．琼脂糖凝胶板的制备 称取一定量的琼脂糖加入玻璃瓶中，按所需凝胶的浓度加入适量的电极缓冲液，用棉塞将瓶口塞紧，置消毒锅4.4×104Pa处理15分钟，或在沸水浴中加热熔化约0.5小时。待该溶液冷却到60℃左右，加入溴化乙锭(取自用水配制的10mg/m1的贮备液，4℃存放)，最后浓度0.5ug/m1。摇匀后，即可用滴管吸取此液，封闭干净玻板(10×15cm)与模框的连接处，以形成一个长方形的模型。然后将“梳子”固定于玻板适当位置上，接着将凝胶溶液注入模型中，使其厚度为3mm。室温放置30-45分钟后，小心地移走“梳子”和模框，即制成了琼脂糖凝胶板。 3．加样和电泳 将琼脂糖凝胶板平移至电泳槽中，注入缓冲液(液面高于胶面)，接通电源，电压应低一点，在负极端每平方厘米的样品孔（深＜3mm)中可加核酸样品10-50ug，体积可达200ul。在样品中应先加入示踪染料(0.2溴酚蓝和40％蔗糖混合水溶液)。随之电压可调高一点，当样品进入凝胶后，使其维持在6v/cm左右．当溴酚蓝移至阳极端时，关闭电源。 4．观察 取出凝胶板，在254nm紫外灯下观察。核酸存在的位置呈现红色荧光区带，照相时，要加红色滤光片。 第五节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS即十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate)是阴离子表面活性剂，它能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。此复合物可用具有SDS聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常把这种电泳称为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS)。用途：是分离蛋白质和测定其分子量。 原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳把蛋白质分开的主要依据： 它的迁移率取决于它所带净电荷、分子的大小和形状等因素。 SDS的主要依据：是各种物质分子量的差异性。因为当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，超越其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除。同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致．所以各种SDS蛋白质复合在电泳时产生的泳动率差异，反映了分子量的差异。 在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈现直线关系。一般用下式表示： lgM=a-bRf 式中M代表分子量．a代表常数．b代表斜率，Rf代表迁移率 综上可知，凝胶浓度不同，其交联度是不同的。交联度随着总浓度(T)的增加而降低。因此，当总浓度一定、交联度增加时，将导致筛孔直径降低。根据这个道理，Rihard等在1965年提出了适