第四章 目的基因的获取PPT.ppt

基因工程的主要技术原理 ;第四章 目的基因的获取;由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。;;大肠杆菌基因组DNA ;plasmid DNA;闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；;;（2） 所用的试剂作用;;冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。;;;（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 ;溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。;溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。;最重要的是：;这是直接决定DNA产量的重要因素之一。;若干常用质粒的理论产量;二、基因组或其他DNA的提取;; 一般过程及原理：;0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 oC温育。; 一般过程及原理： ;;三、DNA的定量和纯度测定;;;一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。;DNA ladder;1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 ;4. ;Relaxed ;;;二 、琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖的浓度（%）;优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。;四、凝胶染色;EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。; ;;UVP全自动凝胶成像分析系统;OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统;DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。;一、Southern blot;;;Southern blot 筛选结果;二、Northern blot;三、 原位杂交;;第四节 基因 扩增技术---PCR;;生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。;（1）;;（3）Taq DNA 聚合酶;;PCR仪;2. PCR技术的原理;双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。;TGCATGCAT;DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。;理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。;3. PCR的过程;94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。;第二步——第三步——第四步;PCR仪的温度循环程序;;需要的模板量极低。;RT-PCR：;自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。;最适温度： 75-80 oC 延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb;金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。;（2）其它耐热的 DNA聚合酶 ;;与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。;即2.75?1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。;③引物的碱基序列 ;尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;3）避免形成引物二聚体（dimer）;⑤引物的Tm值;;设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。;;;;;;;;;;;;;;但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。; dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 ;Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。;借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 ;扩增两个引物外侧的未知序列;;低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。;扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。;;7. PCR技术的应用;在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。;设计引物定点诱变;利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。; 1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：;S