neu与GMCSF共转染树突状细胞的免疫杀伤研究.docVIP

HER2/neu和GMCSF共转染树突状细胞的免疫杀伤研究 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：唐三元, 黄卫国, 伍尤华, 戴文香, 江青山 【摘要】 　　目的: 探讨HER2/neu蛋白细胞胞外段的基因重组腺相关病毒(rAAVHER2/neu)和粒巨噬细胞集落刺激因子重组腺相关病毒（rAAVGMCSF）共转染树突状细胞（DC）诱导的细胞免疫应答。方法: 成熟的DC通过淋巴细胞分离液分离培养获得, 流式细胞技术分析HER2/neu以及细胞表面标志CD1a、 CD83、 CD80、 CD86和HLADR的表达, MTT检测混合淋巴反应, 3HTdR释放法检测CTL杀伤活性, RTPCR检测FasL表达。结果: 共转染组(CT)、 单独转染组(ST)和未转染组（UT） 3组DC的细胞表面标志表达无统计学意义（P0.05）, 共转染组中HER2/neu和FasL的表达比单独转染组高, 共转染组中可以检测到更强的混合淋巴细胞反应和CTL杀伤活性。结论: HER2/neu蛋白细胞外段的基因通过DC的抗原提呈作用可以诱导出免疫应答, 其免疫应答作用与FasL表达相关, 而GMCSF可以增强其免疫应答作用。 【关键词】 HER2/neu 树突状细胞 GM CSF 免疫应答 　　树突状细胞（DC）是最强的抗原提呈细胞（APC）, 能有效地刺激T细胞, 激发T细胞对抗原产生免疫应答。在体外研究中发现DC的抗原提呈能力是巨噬细胞的10～100倍。细胞因子的应用具有安全性和广泛性, 将编码细胞因子的基因导入DC, 可以提高DC的活性, 诱导更强烈的抗肿瘤免疫反应。粒巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）作为DC的一种重要的营养成分, 可以保证DC的存活, GMCSF最终能启动杀伤性T细胞抗肿瘤的免疫应答。本研究中将编码HER2/neu蛋白细胞外段的基因重组腺相关病毒(rAAV)转染DC, 借助DC强大的抗原提呈能力, 作为肿瘤疫苗打破免疫耐受, 激活T淋巴细胞的杀伤能力, 从而诱发机体对HER2/neu过表达细胞的免疫杀伤。同时将GMCSF作为免疫增强剂转染DC, 以增强DC的抗原提呈作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 乳腺癌细胞株SKBR3、 293细胞购自中南大学细胞室, rAAVHER2/neu, rAAVGMCSF由美国阿肯色大学医学院基因治疗中心惠赠。RTPCR试剂和RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司。抗Her2/neu、 CD1a、 CD83、 CD80、 CD86、 HLADR多抗及免疫组化试剂均购自Dako公司。淋巴细胞分离液购自中科院血液研究所。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DC的分离和培养 取乳腺癌患者外周血50 mL用淋巴分离液分离获得单个核细胞, PBS洗涤2次, 用AIMV培养基制细胞悬液, 加入6孔培养板（1 mL/孔）中, 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养4～6 h, 轻轻洗出悬浮细胞（收集后作为T效应细胞）, 在培养板中加入AIMV和GMCSF(终浓度为800 U/mL), 每孔3 mL。DC分为2组: 第1组加入rAAVHER2/neu, 10 μL/孔; 第2组加入293细胞冻融液。病毒作用8h后换液, 除上清后, 加入AIMV+ GMCSF 3mL/孔。第3天换液, 主要悬浮细胞回收, 加入AIMV＋IL4＋GMCSF+TNFα(终浓度200 U/mL), 促进DC成熟。第6、 7天大收集悬液, 同时用PBS冲洗培养板, 收集所有悬浮细胞为成熟DC。 　　1.2.2 rAAVHER2/neu和rAAVGMCSF转染 单独转染组: 2×105个293细胞重悬于0.7 mL的PBS并和含有10 μg的rAAVHER2/neu的0.3 mL PBS混合。通过96孔板法筛选转化的293细胞, 流式细胞术分析HER2/neu的表达。共转染组: 2×105个293细胞重悬于0.7 mL的PBS并和含有rAAVHER2/neu和rAAVGMCSF各10 μg的0.3 mL PBS混合。通过96孔板法筛选转化的293细胞, 流式细胞术分析HER2/neu的表达。 　　1.2.3 自体T效应细胞的扩增 将上述T细胞收集到培养瓶中, 加入RPMI1640＋100 mL/L人AB血清＋GMCSF(终浓度200 U/mL)＋IL2(终浓度200 U/mL), 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱, 隔日半量换液、 传代。 　　1.2.4 DC表面标志及病毒转染后HER2/neu在DC的表达的检测 FITCCD1a、 P