第15章-液相色谱法.pptVIP

1.分离机理 在洗脱过程中，各组分在柱中的保留时间取决于分子的大小。由于小分子可以完全渗透进入凝胶内部孔穴中而被滞留，中等分子可以部分的进入较大的一些孔穴中，大分子则完全不能进入孔穴中，而只能沿凝胶颗粒之间的空隙随流动相向下流动。 样品中各组分按大分子在前，中等分子在中，小分子在后的顺序依次从色谱柱中流出，从而得到分离 2.固定相和流动相 固定相　 多孔凝胶：软质、半软质和硬质 流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低 水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱）； 非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱）。 第三节 平面色谱法 一、 薄层色谱法 二、 纸色谱法 一、 薄层色谱法(thin layer hromatography；TLC) 薄层色谱法：将固定相涂布成一均匀薄层，在此薄层上进行分离样品的方法。 薄板：铺好固定相的板称为薄板。 特点： 快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。 试样预处理简单，对试样限制少。 载样量比较大，适用于制备。 仪器简单，操作方便。 分离能力较强。 灵敏度较高。 分类 吸附薄层色谱法;分配薄层色谱法;离子交换薄层色谱法; 凝胶薄层色谱法 薄层色谱流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在薄板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。 1.基本原理 （1）分离原理（吸附薄层色谱法） 固定相——吸附剂 流动相——液体，又称展开剂 操作方式——薄层板上 原理 组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。 吸附系数不等产生差速迁移，K值大的组分随展开剂移动速度慢，在后；K值小的组分随展开剂移动速度快，在前 。 故薄层色谱又称敞开的柱色谱 （2）比移值和相对比移值 比移值Rf 原点到溶剂前沿的距离 原点到斑点中心的距离 = f R c b R f(B) = c a R ) A ( f = 比移值R意义： 比移值R意义： 可定性分析：条件一定时，Rf是一常数，结构不同的物质，性质不同，其Rf值不同。　　 各组分的Rf值差越大，分离得越开。 Rf与分配系数K的关系: K大，组分在固定相中浓度大，移动速度慢，Rf小。 要求： 各组分的Rf在0.2～0.8之间，两种组分的Rf差值大于0.05 Rf的影响因素 Rf的影响因素 （1)吸附剂的吸附性能 （2)展开剂的极性 （3)薄层板中吸附剂的厚度 （4)展开的时间 （5)色谱缸中蒸气的饱和程度 Rf的缺点： 影响因素很多，很难得到重复的值 　 相对比移值（Rs） Rf小于1，但Rs不一定 Rs在0~∞之间 若Rs=1，试样与对照品一致 原点到对照品斑点中心的距离 原点到样品组分斑点中心的距离 = f R b a Rs = 2.吸附剂的选择 与柱色谱中的吸附剂相似，只是 颗粒更细。 分离效率比柱色谱高 常用的吸附剂 种类：硅胶和氧化铝 规格：颗粒在200目(颗粒直径在10～40μm)左右。 3.展开剂的选择 薄层色谱中展开剂的选择原则与柱色谱中的洗脱剂的选择原则相似。 在薄层分离中一般各斑点的 在0.2～0.8之间，各组分 值之间应相差0.05以上，否则易造成斑点重叠。 薄层色谱法中常用的溶剂，按极性由弱到强的顺序 石油醚＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜水 混合溶剂 先用单一溶剂展开， 若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等， 如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。 还可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。 若要改变比移值时，除了改变展开剂的极性外，还可通过改变吸附剂的活性来调节。 4.操作方法 制板　均匀 点样 距底边1.5～2cm处画一条起始线,试样点的直径一般应小于0.5mm 展开　(多种方式) 预饱和 显色 定性、定量分析 展开 展开的过程就是混合物分离的过程。 展开方式 （1）近似水平法；（2）上行法； （3）多次展开法 ；（4）双向展开法 显色（斑点定位） 直接观察:有色斑点 有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。 化学显色:常用的方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等 通 用 型 硫 酸 乙 醇 溶 液 : 对 大 多 数 有 机 物 能 显 示 出 不 同 颜 色 碘 : 对 许 多 有 机 物 可 显 色 ， 如 生 物 碱 、 氨 基 酸 0 . 0 5 % 荧 光 黄 甲 醇 溶 液 ： 对 芳 香 族 与 杂 环 化 合 物 显 色 专 属 型 茚 三 酮 是 氨 基 酸 专 用 显 色 剂 三 氯 化 铁 － 铁