第5次培养物的观察与检测方法060209.ppt

培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.2 常用的显色标记物 4.2.4 胶体金与免疫金银技术 胶体金(colloid gold)即金的水溶液，为最常用的金属标记物。用胶体金作标记物的ICC称免疫金技术。 免疫金技术和免疫荧光技术一样，免疫染色后即可于镜下观察，无需标记物的显示程序。 供光镜观察的免疫金染色使用的胶体金颗粒直径通常较大，为20nm，镜下呈粉红色。体积大的金颗粒与抗体的结合不十分稳定，这便降低了免疫金方法的敏感度。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.2 常用的显色标记物 4.2.4 胶体金与免疫金银技术 尔后发明的免疫金银技术则有效地避免了这一缺陷。 其原理是：使已在抗原位置沉积的金颗粒发挥催化作用，促进银离子被氢醌（hydroquinone）还原为银原子，后者围绕金颗粒形成一层银壳；银壳本身也具有催化作用，使更多的银离子还原沉积，银壳便增大，镜下呈黑色颗粒。这样抗原的存在部位便显著放大。因而免疫金银技术可以使用与抗体结合牢固的5～10 nm胶体金。 据认为，免疫金银技术敏感度高于PAP法。 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 理想的方法应是敏感、简便、快速以及经济，但主要取决于所研究的标本及其抗原的分布与含量。 一般来讲，估计抗原含量中等以上的标本可应用间接法或SPA法。如果有荧光显微镜则可采用便捷的免疫荧光技术。估计抗原含量中等以下宜采用LSAB法、PAP法或者免疫金银技术。 4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 ICC与免疫组织化学（immunohistochemistry）的不同之处在于后者要做组织切片，细胞被切开后，核与胞质内的抗原暴露于抗体，二者极易结合。而ICC技术的染色对象一般为完整的细胞。 细胞膜在固定后其通透性虽有所增强，但对于抗体这样的大分子仍嫌不够，需进一步提高。常用方法为以去垢剂Triton X脱去细胞膜中最主要的成分脂质。另一方面是要选择分子量较小因而穿透性较大的探针。 用小分子量的荧光素或生物素标记的二抗均比酶标者穿透性大，用SPA代替二抗也是一种明智的选择。而用PAP与胶体金一般较适用于细胞表面抗原的染色。 培养物的观察检测方法 4.免疫细胞化学技术 4.4 免疫细胞化学的一般问题 4.5 免疫细胞化学染色的典型程序 （略） （略） 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 免疫细胞化学是在翻译水平检测基因的表达结果（蛋白质），原位杂交（in situ hybridization, ISH)技术则是检测基因的有无及在转录水平检测基因的活性(mRNA)。 ISH的原理是：应用带有标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测的核酸（DNA或RNA）按碱基配对的原则进行特异性原位结合，此即为杂交，然后通过对标记物的检测而获知待测核酸的有无及相对量。 5.1 探针与标记物的选择 5.2 原位杂交技术主要实验材料 5.3 杂交 5.4 显示标记物 5.5 设立对照 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 5.1 探针与标记物的选择 5.1.1 常用的探针 常用的探针有三种： cRNA探针： DNA探针： 寡核苷酸探针： 前两者的理想长度是100个左右的碱基或碱基对。 目前，cRNA探针应用最为广泛。 一般认为，RNA-RNA杂交体的稳定性强于RNA-DNA杂交体，后者又强于DNA-DNA杂交体。 但是，RNA易于被环境中普遍存在的RNA酶所降解而造成假阴性结果，因此操作要求十分严格。 单链DNA探针由于PCR技术的推广，其合成与操作均比RNA探针简易，应用日渐增多。 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 5.1 探针与标记物的选择 5.1.1 常用的探针 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 5.1 探针与标记物的选择 5.1.2 探针标记物 在上述探针的合成中，均要加入带有标记物的核苷酸。合成RNA探针用标记的三磷酸尿嘧啶（UTP），合成DNA探针用标记的三磷酸胸腺嘧啶（TTP）。应用的标记物有放射性核素以及半抗原等。 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 5.2 原位杂交技术主要实验材料 （1） 标本的制备 （略） （2） 实验所用器具 （略） （3） 溶液配制 （略） 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 5.3 杂交 （1）杂交前处理 （略） （2）杂交过程 （略） （3）杂交后清洗 （略） （4）使用RNA探针杂交的一般程序 （略） （5）使用DNA探针进行杂交的特点 （略） （6）使用DNA探针杂交的一般程序 （略） 培养物的观察检测方法 5.原位杂交技术 5.4 显示标