第六章--培养细胞中克隆基因表达.pptVIP

第六章 培养细胞中克隆基因的表达 本章内容将涉及四个方面： ①基因调控的分子机制； ②分析转染细胞系中基因的功能； ③开发酵母作为单细胞真核模式生物来研究基因 的功能； ④在培养细胞中高水平的产生蛋白质。基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。原核表达系统是了解得最为深入，应用最为广范的表达系统。 第一节 基因调空的研究 一、表达载体 大肠杆菌是主要的克隆宿主，通过在克隆载体上加上转录和翻译调控序列即可使它变为表达载体。 大肠杆菌表达载体带有强启动子经常是可诱导的，如lac或trp操纵子，启动子或T7后期启动子(T7 RNA聚合酶基因从可诱导的启动子表达)。 表达载体还包含了转录终止子和核糖体结合位点、S-D序列。这些元件的排列通过优化产生稳定的RNA和大量的蛋白。 大部分编码蛋白质的真核基因常含有3类转录因子结合区： ①核心元件：包括TATA框和启始子（initiator Inr）。 ②上游元件：包括CAAT 框、GC 框和Oct框等。 ③远上游调控区：包括增强子（enhancer）、减弱子（dehancer）、静息子（sisencer）和上游激活序列（upstream activating seguences, UAS）等。远上游调控元件中增强子和UAS在基因工程中较常用。 原核基因表达特点: (1)只有一种RNA聚合酶； (2)表达以操纵子为单位； (3)转录与翻译偶联； (4)原核基因一般不含内含子； (5)原核基因调控主要在转录水平； (6)原核mRNA的起始密码子前要有S-D序 列。 二.报道基因 ( reporter gene) 报道基因是一种用来检测调控序列功效的外源基因，多编码可被检测的蛋白质或酶。可通过测定报道基因的表达水平来了解在被研究的环境中调控序列的功能和表达水平。报道基因的特点： ①编码的蛋白质活性不能和靶细胞中已存在的某种蛋白质相似。 ②所编码的酶的活性测定应快速、简便、灵敏、特异且重复性好。 ③报道蛋白的功能不会干扰细胞的正常活性。 (1) 氯霉素乙酰转移酶基因（CAT） 氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 是细菌的酶，由E. coli 的 Tn9 编码，它催化乙酰基从乙酰辅酶A上转移到氯霉素 上，使氯霉素被乙酰化而失活，籍此来保护细菌。真 核细胞中没有相似的酶活性。从转染细胞的提取物中 用14C标记的氯霉素温育转染细胞的提取物和薄层层析 可以分析CAT的活性。原理是被乙酰化的氯霉素将进 入上层有机相，而未乙酰化的氯霉素则仍在水相。经 层析，迁移率慢的斑点是未乙酰化的氯霉素，跑得快 的是单乙酰化氯霉素，跑得最快的是双乙酰化氯霉素。 AMG: amelogenin 珐琅蛋白，牙铀蛋白 PA : phosphatidic acid 磷脂酸 MCS: multiple cloning sites 多克隆位点 (2) 荧光素酶(Luciferase, Luc) Luc基因来自荧火虫(Photinus pyralia), LUC的底物是荧光素，催化反应需ATP，Mg2+。用一种特殊的设计的发光计可量度荧光素经ATP－依赖性Luc催化发出的荧光。还有另一种Luc基因来自海肾(sea pansy),这两种荧光素酶的底物特异性是完全不同的。可用来和荧火虫的luc基因重组，用来检测DNA转染效率。 荧光素是不带电荷的荧光素酯类。这种底物很溶易穿过酯双层膜，一旦进入细胞即被内源性的酯酶转变成萤火虫荧光素，成为LUC的底物。 (3)?-葡糖醛酸酶 (?-glucuronidase,GUS) GUS是一种细菌的酶，在植物和哺乳动物细胞中都可用作报 道基因，但因大多数植物缺乏内源性葡糖醛酸酶，故更适合用 GUS。它不会影响高等植物的生长发育。gus的优点之一是有 多种分析方法： ①用X-glu为底物对表达gus或性的细胞和组织进行组织化学染色。 ②用4-MUG(4-甲基荧光素-?-D-半乳糖苷)作底物进行GUS荧光分析，此法较灵敏。 ③以金刚烷基1,2-二氧杂环芳香基葡糖醛酸为底物可进行GUS化学发光分析。其灵敏度比4-MUG高100倍。 (4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP) SEAP编码人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的一个截短的 形式，它缺乏锚顺序，因此可从被转染的细胞中分 泌出来，故可用少量的培养液进行分析。培养液中 检测到的SEAP的活性水平和细胞内SEAPmRNA及 其蛋白质的浓度变化成正比。 SEPA具有极大的热稳定性和对磷酸酶抑制剂(L- 同型精氨酸)有抗性，因此可用65℃预处理样品或加 抑制剂共温育来除去内源性碱性磷酸酶活性。