免疫学检验课件第十章 免疫细胞学技术.ppt

第十章 免疫细胞学技术 第一节 免疫细胞分离技术 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉降法 明胶 右旋糖酐 PVP 二、外周血单个核细胞的分离 d2[?c- ?m(X)] V(X)= × g 18?(X) 形成密度梯度的介质 1.BSA 2.聚蔗糖 Ficoll 3.泛影酸盐 Isopaque Hypaque 泛影葡胺（Urografin) 4.硅胶颗粒 聚乙烯吡咯烷酮 1、Ficoll 分离法 分离介质：Ficoll-Hypaque 原 理：Ficoll-Hypaque密度：1.077 主要材料： 淋巴细胞分离液 RPMI1640培养液 离心管等 肝素抗凝血 分离过程： 结 果： 效果评价： 得率 纯度 活力 注意事项： 密度的选择 加样界面 活力检查 2、Percoll分离法 d2[?c- ?m(X)] V(X)= × g 18?(X) (1) 连续BSA密度梯度离心法 原理： 主要材料： 分离过程： 结果： 三、 淋巴细胞分离技术 （一）淋巴细胞的纯化 1、红细胞的去除 低渗裂解法 氯化铵裂解法 2、血小板的去除 3、单核细胞的去除 尼龙毛分离法 原理： 聚酰胺纤维 主要材料： RPMI1640、 Hanks液 尼龙毛柱 待分离的材料 分离过程： 结果： 注意事项： 1、尼龙毛与尼龙毛柱 2、洗柱速度 3、温度与pH值 （二）淋巴细胞亚群的分离 1. E花环沉降法 2. 尼龙毛分离法 3. 免疫吸附分离法 4. 免疫磁性微珠分离法 5. 流式细胞仪分离法 1、免疫溶解法 原 理： 抗 Thy-1抗体 主要材料： Hanks、补体、RPMI1640 分离过程： 一步法 二步法 结 果： 注意事项： 1、预实验 2、对照组 3、处理细胞的密度 4、补体的来源 5、缺点： 注意事项 1、盘化法分离细胞的使用范围 2、直接法和间接法的比较 3、包被用抗体可以反复使用 4、包被抗体的瓶皿的保存 5、加样体积 玫瑰花环分离法 1。E玫瑰花环分离法 2。EA玫瑰花环分离法 3。EAC玫瑰花环分离法 免疫磁珠分离技术 (一)、原理： 免疫磁性微珠 直接法 间接法 分离细胞的方式： 阳性分离（正选） 阴性分离（负选） 瑞士Dynal公司： 磁珠 基因公司： 磁式细胞分选器 （magnetic activated cell sorter MACS) CD34+造血干细胞分离试剂盒 试剂A1: 为人IgG 试剂A2: 半抗原偶联的抗CD34单克隆抗体 试剂A3: 抗半抗原抗体和磁珠结合物 Mini MACS MACS正选柱 其他： 淋巴细胞分离液 Hanks液 细胞分离过程： 制备外周血单个核细胞,108/300?l 磁标记抗体 磁性分离细胞 结果： 细胞的纯度和活力95% 注意事项：  标记要快速、