耳聋上课资料课件.ppt

DNA的分离和提取 引物的选择和设计 PCR扩增 WAVE系统分析 （杂交，产物过柱、洗脱，结果分析） 测序 单个 洗脱峰 两个以上 洗脱峰 分析突变类型 未检测到突变 实 验 流 程 待检模板经PCR扩增后，用PAGE胶检测产物的特异性和产量，当都满足要求时，可行DHPLC筛查。 PDS基因4号外显子的PAGE胶图 待测样品与野生型样品混合、变性和杂交 野生型样品与突变型样品混合，经变性再缓慢复性后可形成两种异源双链(heteroduplexes)和两种同源双链(homoduplexes)，这一步中异源双链的形成是DHPLC检测的前提。 图片来源于/ 预实验 把经测序证实为阳性的病人模板作为大批量实验之前的预实验样品，既可以验证 DHPLC技术的可靠性也可以优化检测条件。如： PDS10-58.1 ℃，M4563是已经测序鉴定为10号外显子存在突变的病人 2）RFLP 线粒体-RFLP a b 线粒体DNA 1555位点和7445位点RFLP分析原理示意图，箭头所示为酶切作用位点。 a，Alw26I识别序列，*所示碱基为线粒体DNA 1555A；b，XbaI识别序列，*所示碱基为线粒体DNA 7445A 耳聋病人的线粒体诊断 (PCR+RFLP) 自左向右起 第一道100bp Marker,第二道到第四到是酶切前的产物， 第五道到第七到是酶切前的产物 1 2 3 4 5 6 7 3）耳聋基因诊断试剂盒（ 多重PCR+RFLP ） 一.优点 二.选择依据 三.研究方法 四.筛查的结果 优点 多重PCR 可同时检测多个基因的多个突变位点，使已往多次PCR扩增，多次限制性内切酶分析过程简化为一次PCR反应，一次限制性内切酶分析，且大大的节省了标本用量，提高了PCR对遗传性聋病诊断的临床应用价值。 选择的依据 1） GJB2相关位点 GJB2 在遗传性非综合征型耳聋（NSHI）中所占比例相对较高,占的NSHI 50%左右。235delC则是东亚人群发病率最高的突变。有研究报道中国人中儿童语前聋的26-33%为GJB2基因突变所致，而235delC检出率为13.64%-21.5%。仅有一个编码外显子，便于研究 。进行GJB2 筛查后可减少再进行其他高花费的检测，此类检测也可以预测将来后代的再发风险。 2）SLC26A4相关位点 临床比较常见的NSHL相关基因SLC26A4, 又名PDS，仅次于GJB2，5-10%的语前聋与之相关。不同种群的SLC26A4基因突变谱不尽一致。最近研究发现中国人群的SLC26A4基因突变以IVS7-2AG为最常见，占所有SLC26A4基因致病突变的69.1%。 SLC26A4的突变可引起的大前庭水管征，研究表明可通过筛查IVS7-2AG热点突变诊断大庭水管,早期发现此类耳聋患者多可以通过正确的指导和严格的活动限制措施来保存患者较好的残余听力，使患者可以溶入正常的教育环境和社会。 3）线粒体相关位点 对中国语前聋人群的研究发现线粒体突变所致耳聋亦较常见，约占语前聋的5%，且绝大部分系1555AG。mtDNA A1555G突变筛查对药物聋的预防作用。应用基因诊断手段进行孕期母亲或新生儿的线粒体DNA A1555G突变的普遍性筛查,对存在线粒DNA中A1555G突变的个体进行科学的防聋宣教,可以在全国范围内有效的减少药物性耳聋。 研究方法 抽提门诊耳聋病人的外周血gDNA。 DNA的溶解，测OD值，然后把摸板统一稀释到30ng/uL。 订制3对引物，处理引物且每条引物被稀释为100 ng/uL 多重PCR扩增基因GJB2. SLC26A4 (PDS) . 12s rRNA的相应片段 PAGE胶或琼脂糖胶检测，当目的片段和特异性都很好时，可行酶切 三酶切 再次PAGE胶检测 结果判读 酶切前后示意图 （结果判定表） 应用价值 本试剂盒每筛查一个病人的成本只需要10块左右。价格的低廉易于推广，且具有可关的经济效应前景。本试剂盒可以用于基层医院（包括相当一部分的上级医院和科研院所）广泛开展不明原因耳聋（或怀疑药物性耳聋）或代替昂贵的颞骨CT的工具，提前诊断大庭水管综合征患者。使基因筛查提供可能。 本试剂盒只需要简单的实验设备（PCR仪器及跑胶的电泳槽及分子成像仪） 筛查大批量耳聋病人的模板所得出的结果能在统治学上得出有用的耳聋突变数据，数据显示出这3个常见突变引起遗传性耳聋占较大的比例，结果显示湖南地区非综合性耳聋的三个热点突变基因的致病单体的检出率为21.7% ，筛查这些常见突变能快速提高病因诊断，产前诊断及聋儿康复等起作用。 七.风险评估与预防 1.