葡萄抗病毒双价RNAi植物表达载体构建及其对烟草遗传转化.docVIP

葡萄抗病毒双价RNAi植物表达载体构建及其对烟草遗传转化 　　摘要：【目的】为获得兼抗2种葡萄病毒的抗病植物新材料，【方法】利用Gateway技术成功构建了葡萄抗病毒双价RNAi表达载体。先采用RT-PCR分别克隆获得了葡萄卷叶病毒（GLRaV-3）和扇叶病毒（GFLV）外壳蛋白基因保守区段，用重叠延伸PCR方法串联获得了干扰片段GLRaV-GFLV（508 bp）；通过TOPO克隆将该片段克隆入载体pENTR/SD/D构建了入门克隆载体pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV；再经过LR反应使入门克隆载体pENTR/SD/D-GLRaV-GFLV上的干扰片段GLRaV-GFLV替换目标载体pH7GWIWG2（Ⅰ）上的ccdB基因，形成了含2种葡萄病毒基因片段的RNAi 表达载体pH7GWIWG2（Ⅰ）-GLRaV-GFLV，用冻融法将其转入农杆菌菌株EHA105，以此作为工程菌进行转化烟草，【结果】经PCR鉴定证明目的片段已成功转入烟草中。【结论】研究基于Gateway技术的RNAi植物表达载体的构建和对烟草的遗传转化，为诱导转基因植物转录后基因沉默、获得抗2种病毒病的植物新材料提供了可能。 　　关键词： 葡萄； 抗病毒； RNAi植物表达载体； 烟草； 遗传转化 　　中图分类号：Ｓ６６3．1 文献标志码：Ａ 文章编号：１００９－９９８０?穴２０12?雪０6－997－０7 　　葡萄是世界是最古老的果树树种之一，迄今已有5000多年的栽培历史，因其适应强、产量高、营养丰富及具有多种保健功能而深受人们喜爱。近年来，我国葡萄产业得到迅猛发展，已成为一些地区的支柱产业。病毒病是由植物病毒寄生引起的病害，可通过嫁接、昆虫和线虫等途径传播，随着我国地区间引种的日趋频繁，加剧了病毒的扩散和传播，导致一些地区病害蔓延，病毒复合侵染的情况也极为普遍，因此，病毒病已逐渐成为制约我国葡萄产业化发展的重要因素之一。目前，我国各大葡萄主产区病毒病发生极为普遍，其中以卷叶病毒（Grapevine leafroll virus， 以GLRaV-3为主要致病类型[1]）和扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus， GFLV）的发生最为广泛[2]，而且2种病毒复合感染的情况在田间也十分常见，复合感染后往往会加重病症并造成葡萄产量和质量的严重下降。由于现有技术水平下尚无有效的防治措施，国际上主要通过推广无病毒苗木来进行预防，但我国当前相对混杂的苗木市场和分散经营的生产实际导致无病毒苗木很难普及，而培育抗病品种无疑是解决这一问题最为经济、有效的途径。 　　RNA干扰（RNA interference，RNAi）是真核生物的一种高度保守的和序列特异的RNA降解系统，该系统包括植物中的转录后基因沉默（PTGS）、动物中的RNA干扰（RNAi）和真菌中的消除作用（quelling）。作为一种古老的抵抗外来基因（病毒、转座子等）入侵的防御方式，成为基因工程抗病育种中最为有效的一种方法。研究者将构建的沉默载体转入植物，通过其转录产生的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）RNA沉默自上世纪80年代中期以来，利用来自于病毒基因组的部分序列进行植物抗病育种的研究备受关注，其中以病毒外壳蛋白（Coat Protein， CP）基因的应用最为常见[3-4]。目前，利用dsRNA 构建RNAi表达载体的报道已有多例[5]，转化植物后诱导发生的转录后基因沉默效率最高可达100%[6-7]，可以达到抗病的目的，近年来已成为创制抗病毒转基因作物新种质的有效途径。我们拟构建同时包含葡萄卷叶病毒和扇叶病毒外壳蛋白基因保守区段的双价RNAi植物表达载体，进一步转化烟草诱发RNA干扰效应，以期培育兼抗2种以上病毒的抗病植物新材料。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 感病的葡萄材料为欧洲葡萄品种‘郑果5号’，取自中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄种质资源圃。烟草材料为本氏烟（Nicotiana benthaminana）。 　　1.1.2 酶和试剂 pENTRTM/SD/D-TOPO TOPO Cloning Kit，Gateway LR clonase enzyme mix Kit、反转录酶购自美国Invitrogen公司，载体pH7GWIWG2（Ⅰ）购自比利时VIB公司，rTaq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收纯化试剂盒、PMD18-T克隆试剂盒及各种限制性内切酶均为TaKaRa产品，购自大连宝生物工程有限公司，Pfu DNA聚合酶为Fermentas产品，质粒小量提取试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司，大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司，农杆菌EHA105感受态细胞由本实验室制备