20S蛋白酶体表达与类风湿关节炎关系探讨.docVIP

20S蛋白酶体表达与类风湿关节炎关系探讨 　　【摘要】 目的 探讨类风湿关节炎（RA）患者20S蛋白酶体表达水平的变化及其与RA疾病活动性的关系。方法 测定RA患者及正常对照外周血单个核细胞20S蛋白酶体蛋白表达水平。结果 与正常对照相比， RA患者20S蛋白酶体表达升高[（2.92±1.41VS（0.65±0.42）， P 　　【关键词】 类风湿关节炎；20S蛋白酶体；泛素-蛋白酶体途径；炎症 　　类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis ，RA）是一种以对称性、侵蚀性关节滑膜炎为特征的慢性、系统性自身免疫疾病， 炎症为RA发病机制的中心环节。泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway ， UPP）是真核细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径， 20S蛋白酶体是UPP中具有蛋白酶催化活性的核心颗粒。UPP通过调控多种炎症调节蛋白， 在炎症过程中发挥着重要作用[1]。研究显示RA患者血清蛋白酶体及其自身抗体浓度升高， 蛋白酶体抑制剂可缓解关节炎大鼠病情进展[2]， 提示蛋白酶体参与了RA的发生、发展。关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血细胞[3]， 循环单核细胞在RA发病机制中具重要作用[4，5]。RA患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell， PBMC）是否存在蛋白酶体表达及功能异常目前尚未见报道， 本课题通过检测RA患者20S蛋白酶体蛋白表达水平， 对该问题进行了初步探讨。 　　1 研究对象与方法 　　1. 1 研究对象 临床确诊的RA患者30例， 来自西安交通大学第一附属医院风湿科住院患者， RA诊断参照1987年美国风湿病协会分类诊断标准。健康对照28例， 来自西安交通大学第一附属医院体检中心健康体检人员， 排除自身免疫病性疾病。两组研究对象均排除心、脑、肝、肾疾病；急、慢性感染；恶性肿瘤等疾病。 　　1. 2 研究方法 　　1. 2. 1 一般临床资料 记录所有研究对象性别、年龄， RA患者记录病程， 检测类风湿因子、C-反应蛋白（C-reactive protein， CRP）、红细胞沉降率（ehythrocyte sedimention rate， ESR）、自身抗体， 计算发病时的疾病活动性评分DAS28。 　　1. 2. 2 PBMC的分离与纯化 取受试者空腹外周静脉血5 ml， 加肝素钠抗凝（3.8 μl/ml）。采用淋巴细胞分离液（上海华精）密度梯度法分离PBMC。 　　1. 2. 3 20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达测定 采用Western印迹法测定PBMC中20S蛋白酶体C2亚基蛋白表达水平。RIPA裂解液裂解PBMC， 吸取上清液获细胞蛋白裂解液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电转印至NC膜。5%BSA封闭液， 37℃封闭NC膜1 h。分别加入稀释的一抗：proteasome 20S C2 Rabbit Ab （1：1000， Abcam）， Rabbit Anti-β-actin（1：400， 北京博奥森）， 4℃过夜。TBST洗膜5 min×3次， 加入稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1：8000， 北京博奥森）， 37℃孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次。等比例混合ECL发光液（Pierce Biotechnology）， NC膜孵育5 min， 曝光， 凝胶成像分析系统成像保存。所得图像导入Quantity One生物医学图像分析系统进行图像分析处理， 蛋白含量以条带的积分光密度值表示。目的条带和内参照β-actin条带IOD值的比值为目的片段的光密度比值， 表示检测蛋白的相对表达量。 　　1. 2. 4 统计学方法 计量资料以均数 ± 标准差（ x-±s）表示， 正态分布资料两组间差异采用独立样本 t检验， 两变量相关分析采用Pearson相关分析。非正态分布资料采用秩和检验， 两变量相关分析采用Spearman秩相关分析。所有数据处理采用SPSS 16.0统计软件， P 　　UPP与疾病关系的探讨是目前研究的热点， 其功能异常与多种人类疾病相关， 包括自身免疫病和炎症[6]。研究发现， 在系统性红斑狼疮（SLE）、原发性干燥综合症（PSS）、强直性脊柱炎（AS）、类风湿性关节炎（RA）、多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）等多种结缔组织病中存在着蛋白酶体的异常[7， 8]。上述研究主要集中在血清蛋白酶体或其抗体的检测。 　　RA关节滑膜中炎症浸润细胞主要来源于外周血白细胞， PBMC可反映整体的炎症状态[9]， 而UPP通过调控多种炎症调节蛋白在炎症过程中发挥着重要作用。因此， 观察RA患者PBMC中蛋白酶体的变化对于探讨蛋白酶体在RA 发病机制的作用具有重要意义