人巨细胞病毒潜伏激活感染诊断的进展（PPT68）课件.ppt

免疫组织化学技术 IHCT—Immunohistochemistry technique 定义：在组织细胞原位，通过抗原/抗体反应 和组织化学的呈色反应，借助可见的标 志物，对被检测抗原/抗体进行定性、 定位和定量检测的免疫学测定技术。 特点：结免疫学反应特异性和组织化学可见 性为一体；借助先为显微镜放大，于细 胞或亚细胞水平测定抗原/抗体。 免疫组织化学技术 类型：酶免疫组化技术 荧光免疫组化技术 免疫电镜技术 亲和免疫组化技术 （标记物等的不同） 实例： 一、免疫组化技术介绍 （一）标本制作 （二）抗体的选择 （三）抗原/抗体反应 （四）改善标本的通透性 （五）对照项的设立 （六）检测结果的判断 （一）标本制作 标本— 指固定在玻片上用作为抗原的，如 组织、细胞或微生物。 标本的类型—组织切片、印片、涂片。 1.印片法： 优点：操作简单，抗原保存好缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背 景染色。 2.组织切片 组织切片---冷冻切片/石蜡切片介绍： 特点：组织新鲜、速冻，恒温冷冻切片机 片厚5～10μm，-20℃保存；后者只 要求固定的标本，经脱水+浸蜡包埋 常温切片机，片厚2～3μm～ 优点： 前者抗原丢失少，结构保证完好； 后者片薄观察结构清晰，宜连续性可 作回顾性研究。 缺点： 前者细胞清晰度差，现用难保留；后 者抗原量少，易出现非特异着色，需 前处理。 1).切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。 切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片） 标本的固定 标本固定需达到目的：细胞内蛋白凝固 终止胞内酶活性 保持细胞固有态 除干扰性类脂等 理想固定剂：能快速固定细胞抗原 防止抗原物质扩散 固定后抗原的特性不改变 例：10%中性福尔马林液、丙酮、乙醇 标本的保存（温度、时间） 1.冷冻保存：2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80℃冻存。3.蜡块的保存4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。 标本的预处理（目的、注意点）  为什么要进行酶消化和抗原修复？ 醛键形成 羧甲基形成 甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。 抗原修复(Antigen Retrieval;AR) 1 酶消化  (1)原理： 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联 (2)蛋白酶的种类 胰蛋白酶 0.05%～0.1％胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。 胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。 蛋白酶K 20μg/ml，用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制，消化时间37℃ 20～40min。 链酶蛋白酶 0.1%，用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释，消化时间37℃ 1～4h。 无花果蛋