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放线菌WS—13661活性产物快速鉴别 　　摘要：放线菌ＷＳ－１３６６１的代谢产物对农业病原真菌具有很强的抑制活性。试验对其ＨＰＬＣ半制备组分进行生物测定，表明其活性部位在１５～２０　ｍｉｎ；根据ＨＰＬＣ及ＵＶ图谱确定其活性成分为五烯类化合物，对其质谱数据进行分析确定了其分子离子峰，经数据库比对，确定其活性成分为钦氏菌素衍生物。 　　关键词：放线菌ＷＳ－１３６６１；天然产物；快速鉴别；钦氏菌素 　　中图分类号：ＴＱ４６０；Ｒ９１５ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０12）24－5658-04 　　放线菌产生的天然产物是生物农药研究开发的重要来源［１，２］，一方面，放线菌可直接通过发酵产生天然产物制成生物农药，如阿维菌素［３－５］、多杀菌素［６］、井冈霉素［７，８］等，另一方面，以其天然产物为模板，对天然产物结构进行优化改造，是研发高效低毒绿色农药的另一途径，如阿米西达［９］就是以真菌产生的Ｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎ［１０］为先导化合物经人工改造而获得的。然而，随着对环境中放线菌资源的不断挖掘，重复发现已知化合物的几率越来越大，获得新活性化合物的难度越来越大。据湖北省生物农药工程研究中心统计，从随机筛选工作中得到新化合物的概率在１％以下，这就说明，９９％以上的活性化合物为已知成分。因此，从大量样品中快速鉴定活性化合物成为生物农药筛选的关键。 　　ＷＳ－１３６６１是湖北省生物农药工程研究中心从湖南省石门地区采集的土样中分离到的一株放线菌。其发酵提取物经生物测定，对多种农业病原真菌具有较强的抑制活性。经对发酵提取物进行ＨＰＬＣ制备及自动收集，获得了不同时间流出的样品共３６份，经生物测定，确定其活性成分在１４～２１　ｍｉｎ，经ＨＰＬＣ－ＭＳ分析，结合天然产物数据库比对，快速鉴定出了活性产物的化学结构。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 材料 　　１．１．１ 菌种 放线菌ＷＳ－１３６６１，分离自湖南省石门地区山地渣土，由湖北省生物农药工程研究中心保藏。生测用指示菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ、　Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ，湖北省生物农药工程研究中心提供。 　　１．１．２ 培养基 斜面培养基为ＩＳＰ－２琼脂培养基，１８　ｍｍ×１８０　ｍｍ　玻璃试管每管装培养基８～１０　ｍＬ。种子培养基为ＩＳＰ－２不加琼脂，５００　ｍＬ带挡板三角瓶每瓶装培养基１００　ｍＬ，１２１　℃灭菌３０　ｍｉｎ。发酵培养基主要成分为葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉等，５００　ｍＬ带挡板三角瓶每瓶装培养基１００　ｍＬ，１２１　℃灭菌３０　ｍｉｎ。 　　１．１．３ 主要设备 Ｌｙ－０．８型冰冻干燥机，上海东富龙科技有限公司生产；Ｗａｔｅｒｓ高效制备色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ　２５２５泵、Ｗａｔｅｒｓ　２７６７自动收集系统、Ｗａｔｅｒｓ　２９９６二极管阵列式检测器）；Ｗａｔｅｒｓ　２６９５高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ　２９９６　二极管阵列式检测器）；Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｑｕａｔｔｒｏ　ｍｉｃｒｏ质谱仪（电喷雾离子源ＥＳＩ）；Ｍａｓｓｌｙｎｘ　Ｖ４．１液质联用分析软件；查普曼（Ｃｈａｐｍａｎ）天然产物数据库（２００３版）。 　　１．２ 方法 　　１．２．１ 菌株摇瓶发酵 在严格无菌条件下从斜面培养基上取８～１０　ｍｍ２的一块菌苔转移至种子培养基摇瓶中，２８　℃　１５０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养７２～９６　ｈ，然后按１０％的接种量转接至发酵培养基中，　２８　℃，１５０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养１００～１２０　ｈ，即完成发酵。 　　１．２．２ 发酵液的冻干及提取 将发酵液转移至不锈钢冻干杯中，置冻干机中干燥，冻干条件为－４０　℃预冻２　ｈ，冷阱预冷至－４５　℃以下，开启真空泵升华（真空度１０～３０　Ｐａ，升温速率２～３　℃／ｈ，极限温升３７　℃）。取出冻干粉转移至三角瓶中，先用少量５０％甲醇湿润，再加入１００　ｍＬ乙酸乙酯，于摇床上１８０　ｒ／ｍｉｎ振荡萃取１　ｈ，分离出酯相，旋蒸除去溶剂，再以少量甲醇溶解后送ＨＰＬＣ－ＭＳ分析。 　　１．２．３ 提取物的生物活性测定 取一定量发酵提取物加入ＤＭＳＯ溶解，以乙醇稀释至一定浓度后，用９６孔板进行生物测定。组分生物测定采用同样的生测靶标及方法。 　　１．２．５ 提取物的鉴别 根据组分生物测定结果确定活性成分的保留时间，从ＨＰＬＣ图谱中获得活性物质的紫外吸收光谱，从而确定吸收峰的波长。从ＥＳＩ图谱中可判定目标产物的分子离子峰。将吸收峰波长及相对分子质量输入Ｃｈａｐｍａｎ天然产物数据库，查询同该物质性质相同或相近的化合物名称及其化学结构，并进行理化及生物学性质比对，从而确定活性化合物的种类及其化学结构。