环磷酰胺对小鼠精子DNA影响及姜黄素干预作用研究.docVIP

环磷酰胺对小鼠精子DNA影响及姜黄素干预作用研究 　　【摘要】 目的：探讨姜黄素对抗环磷酰胺致小鼠精子DNA损伤的保护作用。方法：成年昆明小鼠随机分成4组：正常组、模型组、姜黄素低、高治疗组。模型组和姜黄素低、高组小鼠按照40mgkg，腹腔注射环磷酰胺（cp），连续5d，同时姜黄素低、高组小鼠每天给予姜黄素混悬液100mgkg，200mgkg灌胃；正常组及模型组小鼠予等量0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，共28d。观察小鼠精子低渗膨胀率，小鼠睾丸组织匀浆后测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH - Px ）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）含量及小鼠精子DNA的完整性。结果：与模型组相比，姜黄素组睾丸组织SOD与GSH - Px含量等均明显升高（P 　　【关键词】 姜黄素；环磷酰胺；精子DNA 　　环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是临床上常用的抗肿瘤药物和烷化剂类免疫抑制剂，对睾丸有损伤作用[1]，影响雄性生殖功能[2]及对后代的潜在致畸危险已经引起医患双方的高度关注。环磷酰胺可导致生殖细胞损伤，使精子微环境发生改变，从而导致精子细胞染色体易位、精母细胞DNA断裂，影响精子DNA完整性，可能是由于自由基清除酶活性降低，使自由基蓄积，类固醇激素合成酶的活性发生改变，从而导致脂质过氧化反应，使生物膜结构破坏。姜黄素（ curcumin， Cur）属于植物抗氧化剂，是从莪术中提取出来的酚性色素，研究报道Cur可以在体外清除自由基、对抗脂质过氧化[3，4]。本实验拟探讨环磷酰胺对小鼠精子DNA完整性的损害及其发生的可能机制，试用自由基清除剂、抗脂质过氧化因子姜黄素，观察其对环磷酰胺致小鼠精子DNA完整性的防治作用以及降低环磷酰胺对精子发生的损害方面具有的重要临床意义。 　　1材料和方法 　　1. 1材料 　　1. 1.1实验动物选用SPF级昆明种雄性小白鼠40只，体质量25～30g，鼠龄6～8周。由湖北医药学院动物中心提供，动物许可证号：SYXK（鄂）2009—0021。于本实验室适应性喂养一周后用于试验。 　　1.1.2药品及试剂姜黄素（美国sigma产品，纯度94%）用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成浓度为100、200mgkg混悬液；环磷酰胺（美国sigma产品）用生理盐水配制成20mgml水溶液。羧甲基纤维素钠由湖北医药学院附属人民医院馈赠。SOD、MDA、GSH-Px、ROS试剂盒购自美国RD公司。 　　1.1.3动物模型SPF级昆明雄性小白鼠40只随机分为4组，分别为正常组，模型对照组，姜黄素低、高治疗组，各10只。模型组和姜黄素低、高治疗组小鼠按照40mgkg·d腹腔注射环磷酰胺，连续5d；正常对照组用等量生理盐水腹腔注射。在造模同时，姜黄素低、高治疗组小鼠每天给予姜黄素混悬液100mg kg、 200mgkg·d灌胃；正常组及模型对照组小鼠予等量0.5%羧甲基纤维素钠，共28d，末次给药24 h后采用颈椎脱臼法处死小鼠，取双侧睾丸组织及附睾。 　　1. 2实验方法 　　1.2.1精子检查精子悬液制备应用扩散法收集附睾尾精子。取双侧附睾置于放入1mL 37 ℃ PBS培养基中，用眼科剪剪碎，放置5min，取500μL精子混悬液，加入1000μL PBS培养基中，调整精子浓度至20×1010 L-1。 　　1.2.2精子低渗膨胀实验（HOS）取待检标本100μL ，加37℃预温的低渗膨胀液1mL，混匀，置37℃水浴30min室温放置2min后取10μL于载玻片上，盖上盖玻片，高倍镜下计数200个精子。 　　1.2.3氧化损伤指标测定取单侧睾丸组织，用4℃PBS在冰水浴中制成10%的组织匀浆，将匀浆3000rmin离心20min，取上清待测。各指标严格按照试剂盒说明书方法进行测定。 　　1.2.4吖啶橙荧光染色法（AOT）测定精子DNA完整性小鼠处死后，取附睾组织制备精子悬液，参照文献[5]用吖啶橙染液对精子进行避光染色。结果用荧光显微镜（520nm激发光）观察精子，计算每只动物200条精子中绿色、红色和橙黄色精子数。其中绿色为DNA双链精子、红色为DNA单链、橙黄色为DNA双链不稳定精子。计算出绿色荧光DNA双链精子的百分率。 　　1 .3统计学方法 　　采用SPSS17.0统计学软件分析，全部数据以±s表示，率的两两比较用卡方χ2检验，组间比较用χ2分割法，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。 　　2结果 　　2.1各组小鼠睾丸组织中SOD、GSH - Px、MDA、ROS含量与模型组相比姜黄素低、高治疗组的睾丸组织中SOD、GSH-Px含量均有明显升高（P 　　3.2姜黄素对环磷酰胺所致小鼠精子NDA损伤的保护作用 　　通过