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脐带间充质干细胞无血清培养实验研究 　　[摘要] 目的 建立一种简单的体外无血清培养扩增人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的方法。 方法 利用酶消化法分离hUCMSCs，在无血清干细胞培养体系下培养扩增，进行形态学观察，CCK-8法分析细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞表面抗原表达及细胞周期，进行成骨、成脂诱导分化。 结果 hUCMSCs呈典型的成纤维细胞形态，具有较强的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达，而CD34、CD45呈阴性表达。3周可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。 结论 利用酶消化法和无血清的培养体系能够快速分离培养出大量hUCMSCs，该方法扩增得到的间充质细胞具备稳定的细胞标记物和生长状态，可用于各种治疗的临床试验。 　　[关键词] 间充质干细胞；脐带；无血清培养液；细胞培养 　　[中图分类号] R446.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）27-0085-03 　　hUCMSCs因来源丰富、体外扩增能力强、免疫原性低、无伦理问题等受到干细胞研究者的重视。无血清培养基因组分较明确，减少了异种血清临床应用的潜在危险。本实验应用无血清培养体系分离培养hUCMSCs，解决其临床应用的生物安全性问题。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　间充质干细胞无血清条件培养基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉诺生物），Ⅰ型胶原酶（Sigma），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105 （BD Biosciences），anti-CD34（Santa Cruz Biotechnology），anti-CD44（Abcam），细胞周期即时检测试剂盒（凯基生物），成骨及成脂诱导分化培养液、茜素红、油红O （Cyagen）。脐带取自剖腹产足月胎儿，由解放军117医院妇产科提供，产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理委员会批准。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 hUCMSCs的分离培养及传代 无菌PBS漂洗新生儿脐带，剪成3 cm的小段，剥离血管，用PBS洗涤干净，剪碎后放入离心管中。加入10 mL 0.2%Ⅰ型胶原酶及5 mL PBS置于37℃孵箱中消化过夜。加入10 mL 0.25%胰酶-0.02%EDTA，37℃消化45min后，200目滤网过滤掉较大团块，用PBS充分稀释，反复混匀后分装入离心管中，室温3 000 rmp离心20 min。弃上清，加入适量培养基混匀。细胞计数，接种密度为106个/cm2，???于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。3～5 d后换液，洗去悬浮的组织和细胞。待细胞生长至80%融合时，PBS清洗2次，加入1 mL预热的0.05%胰酶，待显微镜下细胞变圆后，用旧培养液终止消化，轻轻吹打，吸取细胞悬液于离心管中，室温300 g离心10 min。收集细胞，并计数，以5×103/cm2的接种密度进行传代。 　　1.2.2 CCK-8法检测细胞活性 取生长状态良好的第3代细胞，调整细胞浓度至2×107/L加入96孔板，每孔100 μL，放在37℃、5% CO2的培养箱中培养，7d内在特定时间点，取出96孔细胞培养板每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育1 h。用酶标仪（波长450 nm）测定各孔吸光度值（OD值），以OD值代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。 　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 取对数生长期的细胞，常规消化，1500r/min离心5min，取细胞悬液100 μL（含有2×105个细胞）。加入200 μL预冷乙醇固定，室温孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，尽量避免产生气泡，室温孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室温避光孵育15 min，上机检测。 　　1.2.4 流式细胞仪检测细胞表面抗原 取生长状态良好的细胞，消化并计数，以每管含1×106个细胞，分别加入10 μL单克隆抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105，同型对照10 μL作为阴性对照，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，室温300 g离心5 min，PBS重悬后，上流式细胞仪检测。 　　1.2.5 成脂、成骨诱导分化 待第3代细胞达80%融合，常规消化，以5×104/孔密度接种于6孔培养板（成骨诱导培养皿底部包被明胶），常规培养，待细胞达80%融合时，成脂、成骨诱导组分别加入2 mL成脂、成骨诱导分化液，对照组加入等量基础培养液，一周换液2～3次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，3周后分别进行油红O、茜素红染色。 　　2 结果