骨髓基质干细胞与施万细胞联合移植对周围神经缺损修复作用.docVIP

骨髓基质干细胞与施万细胞联合移植对周围神经缺损修复作用 　　[摘要] 目的 探讨骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（SCs）联合移植对周围神经损伤的修复作用。 方法 雌性SD大鼠48只随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只；制作右下肢长10 mm坐骨神经缺损模型后，A组注入全贴壁法培养的BMSCs与差速贴壁结合阿糖胞苷法培养的SCs，B组仅注入BMSCs，C组仅注入SCs，D组注入磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。分别于4、8周观察动物一般状态，测定坐骨神经功能指数（SFI）、神经传导速度（NCV）以及免疫组化检测表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达水平。 结果 4周时，SFI绝对值A组（53.07±5.36）优于B组（62.73±7.63）、C组（67.17±8.06）、D组（77.56±2.79），差异有统计学意义（P 　　[关键词] 骨髓基质干细胞；施万细胞；周围神经损伤；细胞移植；聚乳酸-聚羟基乙酸导管 　　[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0090-04 　　周围神经损伤是显微外科常见疾病之一，常由交通意外、工矿事故等外伤引起[1]，损伤部位往往呈碾压伤、挫裂伤，造成神经较长距离缺损，单纯手术难以缝合[2]。自体神经移植一度成为治疗的金标准[3]，然而存在损伤供体部位功能的缺点，随着组织工程学的研究进展，导管支架材料联合细胞移植已经成为替代神经移植的重要方法[4]。本研究突破传统的单一细胞移植的方法，采用骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（Schwann cells，SCs）联合移植，探讨两种细胞相互作用对神经轴突再生的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032] 48只，体重（200±5）g；DMEM/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司，美国）；青-链双抗（碧云天，中国）；胰蛋白酶（碧云天，中国）；Ⅳ型胶原酶（碧云天，中国）；阿糖胞苷（Ara-C，辉瑞公司，美国）；兔抗鼠单克隆抗体S-100（武汉博士德公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；兔抗鼠表皮细胞生长因子（EGF）单克隆抗体（武汉博???德公司）；聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管（PLGA，山东代罡生物材料公司）；多导电生理记录仪（ASB240U，成都遨生）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 骨髓基质干细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，浸泡于75%酒精中10 min，无菌条件下取出双侧股骨，剪去两端，将骨髓冲到10 mL离心管中。反复吹打至单细胞悬液，1500 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬。采用全贴壁培养法，将细胞接种于培养瓶中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。培养5 d后，对细胞进行换液，弃去瓶中培养液，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养。待细胞铺满瓶底80%后传代。 　　1.2.2 施万细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，无菌条件下取出双侧坐骨神经，在解剖显微镜下剥离神经外膜，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后剪成0.5 mm小段，加入0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅳ型胶原酶，37℃消化30 min。吸取上清加入培养液终止消化。重复消化1次，将所得单细胞悬液移入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。1500 r/min，离心5 min，弃上清，向离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液5 mL，重悬，移入培养瓶，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。 　　1.2.3 施万细胞的纯化与检测 SCs的纯化采用差速贴壁离心与Ara-C抑制相结合方法[5]，每15分钟变换1次培养瓶方向，45 min后取未贴壁细胞移入新瓶。24 h后加入Ara-C培养2 d，胰酶消化后移入新瓶，待细胞铺满瓶底80%后传代。取第2代细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定后，加入兔抗鼠S-100单克隆抗体（1∶200），4℃过夜，加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗（1∶400），孵育30 min后荧光检测。在100倍显微镜下随机选取10个不同视野，计数阳性细胞与总细胞数，计算SCs细胞纯度，公式为：SCs细胞纯度=S-100阳性细胞数/细胞总数×100%。 　　1.2.4 实验动物的分组与模型制备 48只雌性SD大鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只：A组为