GW9662对正常人和甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化影响.docVIP

GW9662对正常人和甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化影响 　　摘要：目的：研究GW9662对正常人和甲状腺相关眼病（Thyroid-associated Ophthalmolpathy， TAO）患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法：培养正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞，在其增殖和分化的过程中加入GW9662。MTT法观察GW9662对前脂肪细胞增殖的影响，油红O染色定量的方法观察GW9662对前脂肪细胞分化的影响。结果：各浓度实验组的GW9662对眼眶前脂肪细胞的增殖影响较小，各组数据间差异无统计学意义。在各个实验时间段， GW9662对眼眶前脂肪细胞有抑制分化的作用，在48h时作用最明显。与正常人比较，GW9662对TAO患者眼眶前脂肪细胞的抑制分化作用更明显。结论：GW9662可抑制正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞的分化，并可能缓解因眼眶前脂肪细胞过度分化导致的TAO临床症状。 　　关键词：GW9662；眼眶；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化 　　眼眶内脂肪组织的增生是引起TAO眶内容体积增加的重要因素，该过程的发生与眼眶内成熟脂肪细胞的前体细胞——前脂肪细胞的分化增强有关。其中，TAO患者眼眶前脂肪细胞及其分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）表达的增强在该过程中起重要作用。GW9662是PPARs的拮抗剂，可以竞争性结合PPARs配体结合域，从而阻断PPARs配体的作用途径。已有动物模型及实验研究证明GW9662可抑制脂肪细胞的分化[1，2]。本实验研究GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响，以期为临床研究提供实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1眼眶脂肪组织取自行眼球摘除术的患者眼眶，共4例4眼，年龄38～45（平均42）岁。TAO眼眶脂肪组织取自眼眶减压术中，病情分级均为6级，共4例4只眼，年龄37～48（平均44）岁。主要试验材料：DMEM /F-12（1：1）培养液、地塞米松、异丁基甲基次黄嘌呤（IBMX）、转铁蛋白、泛酸钙、三碘甲状腺原氨酸（T3）、生物素、胰岛素、油红O、匹格列酮、MTT粉购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜溶液（DMSO）购自上海生工。 　　1.2 人眼眶前脂肪细胞的原代、传代培养和向成熟脂肪细胞的诱导分化 采用组织块贴壁法培养人眼眶前脂肪细胞并进行诱导??化， 取3～5代的传代细胞进行实验。 　　1.3 GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞增殖的影响 　　将GW9662溶于DMSO中配制成浓缩液，取浓缩液溶解于完全培养液， 终浓度分别为0.1μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L 和10μmol/L 。将前脂肪细胞以5×104/L的密度传代接种于96孔板，每孔100μL。37℃、5%CO2培养12h，换基础培养基继续培养3d，按预先设组分别加入各浓度GW9662干预培养液，设无药物干预培养液为对照组，仅加培养液的空白孔为调零孔。24h， 48h， 72h时，用MTT比色法测定各时相点吸光度的平均值A（表示细胞相对数量），7复孔取平均值。 　　1.4 GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞分化的影响 　　按上述浓度将GW9662浓缩液溶解于诱导分化培养液，无药物干预培养液为对照组，仅加培养液的空白孔为调零孔。将前脂肪细胞以5×104/L的密度传代接种于96孔板，每孔100μL。用完全培养基培养细胞至生长融合2～3d后，改用含各浓度GW9662干预培养液进行诱导分化，13d结束分化。取各组分化细胞各7孔，用40g/L等渗甲醛固定1h，然后蒸馏水漂洗。加入油红O浸泡2h后，三蒸水漂洗数次。置于温箱中蒸发掉多余的水分后，加入异丙醇萃取，用紫外线分光光度计在波长为510nm处测量吸光度（A）。 　　1.5 GW9662拮抗匹格列酮对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞分化的影响 　　将上述诱导分化细胞用含10μmol/L的匹格列酮和10μmol/L GW9662的干预培养液进行诱导分化，13d结束分化。取各组分化细胞各7孔，用40g/L等渗甲醛固定1h，然后蒸馏水漂洗。加入油红O浸泡2h后，三蒸水漂洗数次。置于温箱中蒸发掉多余的水分后，加入异丙醇萃取，用紫外线分光光度计在波长为510nm处测量吸光度OD值（A）。 　　统计学分析：各实验独立重复3次以上，析因设计方差分析比较各不同处理组间及正常人与TAO患者前脂肪细胞间的差异。所有统计分析由SPSS11.0统计软件分析完成，检验水准ɑ=0.05。 　　2 结果 　　2.1 GW9662对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞增殖的影响 　　GW9662浓度分别为0.1μmol/L，1μmol/L ，10μmol/