南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系建立.docVIP

南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系建立 　　摘 要：养殖对虾可混合感染多种病毒，桃拉病毒（Taura syndrome virus， TSV）和白斑病毒（White spot syndrome virus， WSSV）是南美白对虾感染的主要病原体，建立TSV和WSSV的多重聚合酶链式反应 （PCR）技术可有效防制疫病的爆发。根据GenBank公布的TSV和WSSV全基因组序列，分别设计TSV和WSSV的特异性引物，并在四种不同的PCR系统中扩增筛选，在同一电泳道内得到与预期结果相符的、可明显区分的2条特异条带，PCR扩增产物测序显示分别与TSV和WSSV基因序列吻合，本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础。 　　关键词：南美白对虾；桃拉病毒；白斑病毒；多重PCR；检测 　　中图分类号：S188 文献标识码：A 　　我国沿海地区是南美白对虾养殖的主要产业区，在人工养殖环境中，对虾可同时感染几个病原体或病毒。优质的南美白对虾亲虾及虾苗主要从国外引进，同时也有可能将潜在的病毒带入境内。桃拉综合症病毒（Taura syndrome virus， TSV）和白斑症（White spot syndrome virus， WSSV）一直是对虾养殖中的主要病毒原，这两种病毒对对虾养殖一度造成严重的危害，并有混合感染引起大规模死亡的情况发生[1]。 　　对虾TSV和WSSV的检验方法主要有肉眼外部症状观察、显微镜观察、组织病理学实验、抗体实验和聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）等方法[2，3]。其中PCR被证明是检测对虾病毒感染高效、简单及快速的诊断工具。RT-PCR技术已应用于对虾WSSV和TSV病毒的检测，但一次PCR只能检测一种病原体样本[4，5]。多重PCR是一种特殊PCR形式，其突出特点是一次PCR反应即可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床诊断TSV和WSSV的混合感染具有很高的实用价值[6，7]；但是多重PCR检测方法受多种因素影响，如引物的特异性、模板的质量以及不同病毒样本PCR的扩增条件均能影响检测的灵敏度和准确性。本研究通过优化PCR扩增条件，建立了高效的南美白对虾TSV和WSSV多重PCR检测技术，这一检测体系具有很高的特异性和较高的灵敏性。 　　1 材料和方法 　　1.1 样品采集 　　疑似TSV和WSSV感染对虾在绍兴地区沿海岸线共5个对虾养殖基地进行对虾样品收集，对虾采集时在一??地点的不同池塘里捕捞对虾，然后随机抽取一定数量的样品，运至绍兴文理学院冻于-80℃冰箱中。 　　1.2 核酸提取 　　1.2.1白斑病毒DNA提取 　　取疑似WSSV发病对虾内脏组织共约0.1g，加入200μL裂解液（0.4M NaCl，10mM Tris-HCl， 2Mm EDTA， pH 8.0）研磨均匀后补加100μL，6000g 离心去杂质及细胞碎片，取上清液；在上清液中加入30μL 20%SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K混合均匀，在55℃温育1-2h；在反应液中加入苯酚，氯仿，异戊醇（25：24：1）去除残余蛋白，离心后取上清；加入等体积异丙醇混匀，-20℃沉淀30min，10000g在4℃离心10min，加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL双蒸水中于-20℃备用。 　　1.2.2桃拉病毒RNA提取 　　按Invitrogen公司Trizon试剂盒操作方法提取发病对虾腹部及内脏部桃拉病毒RNA，按Promega公司试剂盒操作方法合成cDNA，1μLTSV模板分别加入PCR反应体系12.5?l（2×Taq PCR MasterMix，北京艾德莱生物科技有限公司），以上各项步骤严格按照试剂盒操作。 　　1.3 引物的设计和合成 　　根据GenBank公布的WSSV和TSV全基因组序列，分别设计TSV和WSSV的2个特异性引物，引物由上海生工合成。WSSV PCR检测用的引物：5’ -TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT -3’，5’ - CACGAG TCTACCGTCACAACATC -3’ TSV RT-PCR检测用的引物： 5-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3 ，5-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3 　　1.4 PCR反应体系的建立和优化 　　1μLTSV和WSSV模板分别加入PCR反应体系12.5?l（2×Taq PCR MasterMix，北京艾德莱生物科技有限公司），再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5?l，加重蒸馏水至终体积25μL。为筛选扩增条件，设计四种不同的反应体系： 　　1.4.1：95℃2min，94℃30S，68℃ 1 min，35个循环；68℃ 2 mi