药物分析 第十一章抗生素类药物.ppt

讨论： （1）柱效：以C2峰计算，理论塔板数不得低于2000。（2）流动相：流动相极性应适当控制（适当调节甲醇比例）：极性过强，出峰快，分离不佳；流动相极性过弱，出峰太慢。 （3）衍生化试剂与衍生物的稳定性； （4）离子对试剂浓度影响； (四)硫酸盐测定 本类抗生素临床应用的主要为硫酸盐，各国药典规定EDTA络合滴定法测定硫酸盐，作为组分分析。 四、含量测定 本类抗生素的效价测定目前各国药典主要采用微生物检定法。近年来国内外又有各种免疫法、色谱法等定量分析方法。 由于本类抗生素多数无紫外吸收，不能直接用紫外或荧光检测器，需进行柱前或柱后衍生化，采用的衍生化试剂有邻苯二醛、1、2-萘醌-4-磺酸、2、4、6-三硝基磺酸、1-氟-2、4-二硝基苯、9-芴甲基氯甲酸酯、茚三酮等。 示例 猪组织中庆大霉素和新霉素的HPLC法 色谱条件：Hypersil BDS C18分析柱；乙腈-水（85：15）为流动相；流速1.0ml/min；荧光检测器，λex=260nm，λem=315nm。 样品处理：取样品（肝、肾、肌肉）适量，加磷酸盐缓冲液（Ph=7.4），室温孵育1h，然后加 三氯乙酸，匀浆30s，于4℃下离心（3500r/min）15min，将上清液移置另一试管中，加离子对试剂（已烷磺酸钠溶液）。再经固相柱提取纯化，用乙腈-0.02mol/L已烷磺酸钠（55：45）洗脱。洗脱液与9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC-Cl）混合，进行衍生化反应，15min后加甘氨酸中止反应，取适量进样测定。图谱 结果与讨论： 用FMOC-Cl衍生化可获得强荧光的衍生物，在pH8.0的条件下反应，衍生物可稳定在12h。见图11-7。 测得庆大霉素各组分和新霉素的提取回收率在75%-86%之间；日内、日间RSD小于10%；检测限分别为0.05μg/g和0.1μg/g（S/N=5）；定量限为检测限2倍。在0.1μg/g-1.0μg/g范围内，被测组分浓度与响应值之间呈良好的线性关系，r0.999。 第四节 四环素类抗生素（tetracyclines antibiotics ） 这类抗生素有四个环构成，故统称为四环素类抗生素。 一、化学结构与性质 结构中各取代基R、R′、R″及R的不同构成各种四环素类抗生素。常见结构如下： 2．性质 （1）酸碱性与溶解度：显弱碱性和显弱酸性，是两性化合物。 （2）旋光性：具有不对称碳原子，因此有旋光性； （3）紫外吸收和荧光性质： （4）与金属离子形成配位化合物： （5）稳定性：四环素类抗生素对各种氧化剂（包括空气中氧在内）、酸、碱都是不稳定的。 本类抗生素具有氢化骈四苯的共同基本母核，均是化学两性物质，可与酸、碱成盐，但在碱性水溶液易降解，在酸性水溶液稳定，一般以盐酸盐应用于临床。 A差向异构化性质：四环素类抗生素在弱酸性（pH2.0-6.0）溶液中会发生差向异构化。 差向四环素 四环素 B降解性质： 酸性降解，在酸性条件下（pH2）生成脱水四环素（anhydrotetracycline，ATC）。反应式如下： 四环素 脱水四环素 碱性降解：在碱性溶液中生成无活性的异构体。反应如下： 异四环素类抗生素 四环素类抗生素 二、鉴别试验 1．浓硫酸反应； 2．三氯化铁反应； 3．薄层色谱法： 应用示例 盐酸土霉素的鉴别 薄层板的制备：硅藻土EDTA-2Na溶液-甘油（95：5）为粘合剂；展开剂：取4%EDTA-2Na溶液（pH7.0）5ml，加至醋酸乙酯-氯仿-丙酮（2：2：1）200ml中为展开剂，展开后，氨薰后，置紫外光灯下（365nm）下检视。 4．HPLC法：ChP和USP（25）采用HPLC法鉴别盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西霉素、盐酸金霉素等。在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。 三、特殊杂质检查 1．有关物质：四环素类中的有关物质主要是异构体杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。 2．杂质吸收度：如ChP规定的盐酸四环素的杂质吸收度测定方法如下： 取本品加0.8%氢氧化钠溶液制成每1ml中含10mg的溶液，照分光光度法，置4cm的吸收池中，在530nm的波长下测定，自加0.8%氢氧化钠溶液起5min，其吸收度不得过0.12（供注射用）。 四、含量测定 四环素类抗生素的含量测定，目前各国药典多采用HPLC法。 示例：盐酸四环素的含量测定方法： 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基键合硅胶为填充柱（pH值适应范围大于8.0）；0.1mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液（68：27：5），用氨试液调节pH至8.3为流动相； 流速1ml/min；柱温35℃；检测波长为280nm