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以苯硼酸为识别物质电化学阻抗糖传感器制备 　　1引言 　　糖类在生物体中起着极其重要的作用。它涉及生物学及病理学过程，如信号传导、细胞粘附、癌症转移等过程，也是生物体进行新陈代谢所需能量的主要来源[1-3]。因此，分析检测糖类化合物显得十分重要。目前，已报道的糖类化合物分析方法有电化学法[4]、电化学发光法[5]、荧光法[6]、石英晶体微天平法[7]、表面等离子体共振法[8]等。电化学交流阻抗技术（EIS）是利用小幅度交流电压或电流对电极扰动，测量体系对扰动跟随情况的电化学响应的测量方法。该方法具有频率范围广、对体系扰动小等特点，是研究电极过程动力学、电极表面现象等的重要工具[9，10]。 　　目前，糖类化合物的检测主要基于糖和与糖可结合分子（如糖结合蛋白、凝集素、硼酸基团等）之间的弱相互作用[11-13]。硼酸及其衍生物能与二醇可逆高效地共价结合而形成环状的硼酸酯，因此可将其作为生物传感器的分子探针来识别糖类化合物[14-16]。相比糖传感器的其它识别单元，硼酸具有价格低廉、稳定性好、易可逆再生等优点[17]。已报道的作为分子识别物质检测糖的硼酸有苯硼酸、氨基苯硼酸、巯基苯硼酸等[18，19]，其中巯基苯硼酸因易在空气中氧化、室温下不稳定等缺点在生物传感应用方面受到限制。合成稳定的硼酸类衍生物作为糖传感器的识别单元是糖传感器研究的一个方向[20]。 　　本研究选择苯硼酸为糖的识别物质，首先由半胱胺与4甲酰基苯硼酸反应合成Schiff′s碱，通过自组装方式将合成的硼酸Schiff′s碱固定于金电极表面，以电化学交流阻抗法为检测技术，构建非标记、灵敏度高、稳定性好的电化学交流阻抗糖传感器。电极上固定的硼酸可与糖化合物上的二醇可逆、高效地共价结合形成环状的硼酸酯，利用传感器与糖结合前后阻抗值的变化，分析检测葡萄糖、乳糖和甘露聚糖，并且分别考察传感器与3种糖的结合能力。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　电化学系统为CHI 660电化学分析仪（上海辰华仪器公司），电极为三电极体系：工作电极为金电极（Φ=2 mm）或修饰电极，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl（饱和KCl）电极。 　　半胱胺（Cysteamine??CA，Mw=77.15 g/mol）、甘露聚糖（Mannan from Saccharomyces cerevisiae，Mw =46000 Da）和4甲酰基苯硼酸（4Formylphenylboronic acid，BA，Mr=149.94 g/mol），均购自SigmaAldrich公司。乳糖（C12H22O11·H2O，天津市化学试剂一厂）。葡萄糖（C6H12O6·H2O，西安化学试剂厂）。其余所有试剂均为分析纯。实验所用水为MilliQ超纯水（ 　　18.2 MΩ cm，Millipore公司）。 　　0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）。0.2 mol/L半胱胺溶液的配制：准确称取0.1543 g半胱胺，以超纯水溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，避光保存备用。0.2 mol/L 4甲酰基苯硼酸溶液的配制：准确称取0.3000 g 4甲酰基苯硼酸，用5 mL无水乙醇溶解后，加入5 mL碳酸盐缓冲液（pH 9.0）定容至10 mL容量瓶备用。葡萄糖、乳糖、甘露聚糖储备液均由0.1 mol/L PBS（pH 7.4）配制，其中葡萄糖的储备液需放置24 h后使用。不同pH值的5 mmol/L K3[Fe（CN）6]K4[Fe（CN）6]检测溶液分别用不同pH值的0.1 mol/L PBS配制。 　　2.2电化学糖传感器的构建 　　传感器的构建步骤如图1所示。（1）Schiff′s碱（BACA）的制备移取5 mL 0.2 mol/L半胱胺水溶液于圆底烧瓶中，向其中逐滴加入5 mL 0.2 mol/L 4甲酰基苯硼酸溶液，40 ℃水浴反应2 h，得到淡黄色沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到Schiff′s碱（BACA）[21]。Schiff′s碱的核磁共振氢谱数据如下：1H NMR（300 MHz，CD3OD），δ=3.90（s，4H，CH2CH2）， δ=8.32（s，1H，N=CH）， δ=7.43-7.48（s，4H，ArH）。准确称取0.0400 g Schiff′s碱（BACA），溶于1 mL无水乙醇中，制得0.04 g/mLSchiff′s碱储备溶液。（2）糖传感器的制备金电极的预处理：将金电极用0.03 μm Al2O3溶胶研磨，然后依次用乙醇、超纯水分别超声清洗5 min，再将金电极在0.1 mol/L H2SO4溶液中，0 - 1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描，直至获得稳定的循环伏安曲线，用超纯水淋洗后备用。将预处理好的金电极浸入0.04 g/mL