10动物细胞培养与表达制备药用蛋白.pptVIP

一、分类 原代细胞： 二倍体细胞： 连续细胞系： 融合细胞： 基因工程细胞：转了目的蛋白基因的细胞。 转化细胞：细胞遗传物质发生改变，能无限传代的细胞。 二、常用细胞株 CHO细胞：中国仓鼠卵巢癌细胞 Vero细胞：非洲绿猴肾细胞 BHK-21细胞：地鼠肾细胞 WI-38细胞：人胚肺成纤维细胞 三、细胞冷冻保存 冷冻保护液：含10%小牛血清培养基中加10%甘油或DMSO 慢冻快复苏： 液氮气相：-70 ℃ 液氮液相：-196 ℃ 11.6 动物细胞小规模培养 一、悬滴培养：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及培养液悬挂在盖玻片下，再置放于一凹形载片上，最后用熔蜡密封后放入培养箱中培养。 二、灌注小室培养：细胞培养于密闭小室内，培养液从一侧流入，另一侧流出。培养液可以循环供应。细胞生长可以少受代谢产物积累的影响。 三、培养瓶培养：玻璃、一次性塑料 四、培养板培养：一次性塑料 五、转管培养：管状培养器皿固定于一旋转装置上。 六、转瓶培养： 11.7 动物细胞大规模培养 一、悬浮培养：少数动物细胞属悬浮生长型。细胞增殖快、产量高、培养过程简单。 二、微载体培养： （一）多孔微载体的优点：易固定化、大比表面积可保证细胞充分的生长空间、细胞生长在载体内部，可免受机械损伤、还可提高搅拌强度和通气量，强化传质。 如：高温烧结的多孔陶瓷载体 （二）微载体培养细胞的步骤 1、选择合适的微载体类型 2、浸泡水化及消毒 3、接种 4、培养观察与细胞计数 5、消化与细胞回收 6、细胞收获 7、传代培养 三、中空纤维法 空心纤维是由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。细胞在其上贴附生长，水分子、营养物质和气体可以透过。 培养系统的核心部分由3-6层空心纤维组成，细胞接种于空心纤维的外腔。 11.8 动物细胞培养的生物反应器 一、柱状中空纤维反应器 二、板框式中空纤维反应器 三、中心灌流式反应器 四、灌流微载体生物反应器 五、旋转壁式反应器 11.9 动物细胞大规模培养的影响因素 一、氨 二、乳酸 三、甲基乙二醛 四、二氧化碳 五、渗透压 六、载体 七、细胞死亡与凋亡 八、参数控制 11.10 动物细胞表达制备药用蛋白 11.10.1 转基因方法 一、细胞转染外源基因的方法 1、暂时转染：质粒在宿主细胞中不必停留很长时间，DNA被转录成mRNA，随后翻译成蛋白质，并不进入细胞基因组。如：磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法。 2、永久性转染：反转录病毒载体法可以产生永久有效的转染。 基因转移的方法 （一）物理方法： 1、电穿孔法：利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔，从而使外源DNA转移至细胞中。 2、微注射法： 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，然后处死雌鼠，取出受精卵。 然后借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内。 将该受精卵移植到另外一只假受孕母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。 3、裸露DNA直接注射法：将裸露DNA直接注射到组织中，DNA有可能直接被细胞摄入。 基因转移的方法 （二）化学方法 1、DEAE-葡聚糖法：将外源DNA片段与DEAE-葡聚糖等高分子碳水化合物混合，这样DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正电荷基团上，从而形成DNA大颗粒。后者黏附于受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。 2、磷酸钙-DNA共沉淀法 将待转化的DNA溶解在磷酸根离子的缓冲液中，在特定PH下加入氯化钙溶液混合均匀。此时磷酸钙与DNA共沉淀形成大颗粒。加入受体细胞培养一段时间后，DNA就通过脂相收缩时裂开的空隙进入细胞，或者在钙、磷的诱导作用下被细胞吞噬而进入细胞内，从而使外源DNA整合到受体细胞中得到表达。 当核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式存在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。此法比DEAE-葡聚糖法转染效率高100倍，但还是比较低。 3、脂质体载体包埋法：将需转移的外源DNA 或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。 此法转染效率高。 基因转移的方法 （三）生物学方法 病毒介导的基因转移：DNA 病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体）、反转录病毒载体。 腺病毒载体：全长36kb，其包装上限为原基因组的105%。具有安全性好、不整合人染色体、不导致肿瘤发生、宿主范围广、对受体细胞分裂周期要求不严、外源基因在载体上容易高效表达等优点。 反转录病毒载体：一种传染性病毒，含RNA遗传物质，可将非病毒基因转移至分裂细胞。感染进细胞的RNA反转录产生DNA互补链，该DNA又可以作为合成第二条DNA链的模板。这两条链可渗入受体细胞基