高效液相法测定血中儿茶酚胺性能评价课件.pptVIP

第三十章 层析法测定生化物质 * 第*页 第四节 其他生化物质的层析法测定 一、儿茶酚胺激素测定 肾上腺髓质主要分泌肾上腺素(epinephrine,E)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)（约占10～30%）及微量的多巴胺(dopamine,DA)。这三种具有生物活性的物质在化学结构中均含有儿茶酚（邻苯二酚）及连接其上的乙胺侧链，生理功能也有许多共同点，故统称为儿茶酚胺（catecholamines，CA)。 第*页 第*页 （一）测定方法概述 正常情况下,体内儿茶酚胺浓度很低,需要用高灵敏的分析方法。常用的有HPLC法、荧光法、放射酶学法、气相色谱法等，其中以HPLC法应用较多，主要是因为它的高分离效率，HPLC法同电化学检测和荧光检测相结合是目前普遍的方法。 VMA的测定早期有化学比色法、纸层析、薄层层析、醋酸乙酯高压电泳法等,精确性差,费时。近年来, HPLC法测定尿中VMA较多。 第*页 第*页 （二）高效液相法测定血和尿儿茶酚胺 多采用阳离子交换柱反相HPLC-电化学检测法测定，也可用离子对反相HPLC或普通反相HPLC-电化学检测法。可同时检测DA。采用HPLC同质谱及化学发光联用测定儿茶酚胺类的方法是：血浆或尿液样品的处理采用氧化铝吸附法，标本中加入内标物，在碱性条件下儿茶酚胺被活性氧化铝吸附，离心并弃取上清液；加去离子水反复清洗至中性后，加入高氯酸反抽氧化铝中的儿茶酚胺，吸取上清液进样检测。标准液加入内标物进行同样处理。在C18反相层析柱上待测液经HPLC分离，最后洗脱液用电化学或荧光检测仪进行定量。 第*页 1.由于血中儿茶酚胺生理浓度较低，一般采用较敏感的电化学方法或荧光检测仪进行测定。由于血浆和尿液中各种成分较多，多采用氧化铝吸附法或微小柱常规分离。 2. 儿茶酚胺类物质本身有自然荧光，经HPLC法分离后，可以利用其荧光进行检测，但是由于儿茶酚胺类物质的自然荧光相对较弱，因此可以通过衍生化形成具有强荧光的物质，借此提高检测灵敏度。 第*页 （三）高效液相法测定血中儿茶酚胺性能评价 第*页 3. HPLC是使用高效液相荧光、电化学和紫外检测等测定尿中VMA含量，可避免饮食、药物等干扰, 灵敏度高，检测结果准确、可靠,分析时间也大大缩短。但HPLC法需特殊仪器设备,填充柱价格昂贵,检测成本高。 第*页 （三）高效液相法测定血中儿茶酚胺性能评价 第*页 （三）高效液相法测定血中儿茶酚胺性能评价 4.血浆和尿儿茶酚胺的检测，需特别注意检测前因素的影响。E和NE都是主要的应激激素，任何应激状态都可导致其大量释放，如由卧位突然变为站位，血中E和NE可立即升高2~3倍。E和NE极易氧化，在采血后若不立即分离红细胞，室温下E和NE浓度将迅速下降。故采血后需尽快分离血清。多数降压药都可影响儿茶酚胺的释放，故在采血前3~7天应停用降压药。 第*页 5. 由于儿茶酚胺和拟肾上腺素易被氧化，因此样品需要在低温和避光条件下进行处理。样品可保存在密闭的聚丙烯管中(玻璃容器易产生吸附)，在－60～－80℃暗处贮存，不能多次冻融。（不需要低温和避光处理） 第*页 （三）高效液相法测定血中儿茶酚胺性能评价 第*页 血清中骨性碱性磷酸酶（bone alkali phosphatase，B-ALP）是近年来主要用于小儿佝偻病早期诊断和亚临床鉴别的特异性参考指标,也是目前用于评价人体骨矿化障碍的最佳指标。 第*页 二、骨型碱性磷酸酶测定 第*页 （一）骨型碱性磷酸酶测定方法概述 测定B-ALP的方法就是采用物理、化学或生物学方法先识别或分离出B-ALP，再测定其碱性磷酸酶的活性。 1．高效液相层析法 是ALP同工酶分辨率最高的一种检测方法,能够清楚分出B-ALP。国际上对B-ALP的研究都基于HPLC检测，其采用阴离子交换HPLC法，乙酸以0.8m1/分流速，流经一种薄的阴离子交换柱，梯度洗涤ALP同工酶。柱后流出物与底物混合，于405nm波长检测产物对硝基酚的含量。 第*页 二、骨型碱性磷酸酶测定 第*页 2.麦芽凝集素沉淀法 由于ALP同工酶的糖基化不同，麦芽凝集素能选择结合B-ALP的N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸残基，离心沉淀，测定上清液中B-ALP的活性。 3.酶免疫活性分析法 将抗-B-ALP包被在固相载体上，标本中抗原ALP与抗体特异性结合，与抗体结合的B-ALP催化对硝基酚磷酸二钠，405nm比色。 第*页 二、骨型碱性磷酸酶测定 第*页 二、骨型碱性磷酸酶测定 4．电泳法 有亲和电泳法和琼脂凝胶电泳等。亲和电泳是利用麦胚凝集素(WGA)特异地与B-ALP结合形成WGA-B-ALP复合物,该复合物在电场中不泳动或泳动很慢,从而将骨、肝型ALP清楚