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重组DNA基本方法 目的和要求 1. 了解基因工程的基本流程； 2. 学习质粒载体的提取、纯化方法； 3. 了解限制性内切酶的特点与基本操作方法。 原理 基因工程的基本流程： 操作步骤（一） 一、载体制备——质粒的分离与纯化 主要试剂：P117 1. LB 5. 溶液III 2. STE 6. 酚:氯仿（1:1 V/V） 3. 溶液I 7. TE（pH8.0） 4. 溶液II 8. RNase 一、载体制备——质粒的分离与纯化 1. 将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀。 2. 加200μL溶液II，盖紧管盖，快速颠倒离心管5次混匀（勿强烈振荡），冰浴1~2min。 3. 加150μL溶液III，盖紧管盖，温和振荡10sec，冰浴5min。 4. 10000rpm离心5min，将上清移至一干净的1.5mL离心管中。 5. 加等体积酚:氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，取上清移至一干净的1.5mL离心管中。 6. 加2倍体积无水乙醇（约1mL），振荡混匀，冰浴10min。 7. 10000rpm离心5min。 8. 弃上清，加1mL 70%乙醇振荡漂洗沉淀，10000rpm离心2min。 9. 弃上清，室温下倒置10~15min晾干沉淀。 10. 加20~25μL含RNase（无DNase）的TE溶解DNA，37℃消化30~60min。 11. 取5μL质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳观察。（与二一起做） 操作步骤（二） 二、质粒DNA的限制性内切酶消化 主要试剂：P119~120 1. 质粒DNA 4. 1 × TBE电泳缓冲液 2. 10 × 反应缓冲液 5. 0.9 %琼脂糖凝胶 3. 限制性内切酶 6. 上样缓冲液 7. 分子量标准 二、质粒DNA的限制性内切酶消化 1. 灌制凝胶 2. 酶切反应： 质粒DNA 5μL 10 × 反应缓冲液 2μL 限制性酶溶液 1U（10μL） 无菌水至总体积 20μL 轻弹管壁，混匀各成分，37℃保温30~60min。 3. 电泳观察。 * * 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 *