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乙型肝炎患者病毒复制检测与分析 　　【摘要】目的 分析乙肝病毒复制检测方法，为乙肝病程评价及抗病毒疗效的观察提供依据。方法：用免疫发光法检测乙肝三系；用荧光定量PCR检测HBV DNA；ELISA法检测LHBs和Pre S1；用基因芯片进行基因分型，S基因序列同源性测序复核优势基因型。结果：pre-S1检出率为49.19%；LHBs检出率为87.10%，经统计LHBs、HBV DNA与pre-S1有统计学意义差异（P 　　【关健词】乙型肝炎病毒；病毒复制方法；基因芯片分型；优势型分析；分析 　　【中图分类号】R373.2【文献标识码】B【文章编号】1672-3783（2014）01-0291-01我国是乙型肝炎（以下简称乙肝）的高发地区，在众多的无症状病毒携带者中可引起急、慢性肝炎，并导致肝硬化和肝癌，由于治愈困难，且愈后较差，已成为危害广大人民群众健康的社会性问题[1]。对乙肝病程评价及抗病毒疗效的观察，长期以来，主要以肝功能改善、HBV-DNA转阴及HBeAg的血清转换为指标。随着HBV基因组中开放读框功能的确定，以及前S区在乙肝病毒发病机制、感染及复制等方面的研深入究， 使人们逐渐认识到乙肝前S区在判断病毒复制及抗病毒治疗疗效的重要性[2]，了解乙肝患者体内的病毒复制情况，HBeAg阴性慢性乙肝患者，其体内是否有病毒复制，我们对常用的检测HBV-DNA、HBV-LP、前Pre-S1、基因分型及HBeAg等血清学指标方法，探讨乙肝患者中病毒复制及临床意义。现将结果报告如下. 　　1材料与方法 　　1.1标本来源 （1）病人标本 采集124例医院门诊与住院慢性乙肝病人血液标本。病人均经临床和实验室检查确诊，诊断符合病毒性肝炎防治方案标准[3]，血清学指标为HBsAg阳性、HBeAg阳性、抗HBc阳性；（2）对照标本 30份阴性对照血清，采自本院非乙肝患者，乙肝三系标志均阴性、HBV-DNA用PCR检测低于检测值，采血后分离血清，置-20℃冰箱内保存备用。（3）乙肝临床分组标本 选取本院2010年2月以来住院患者中血清HBV-DNA阳性患者100例。诊断标准按病毒性肝炎防治方案[2]，其中，急性乙型肝炎20例，慢性乙型肝炎轻度20例，慢性乙型肝炎中重度20例，重型乙型肝炎20例，乙肝合并原发性肝癌20例。男性71例，女性29例，平均年龄43±17岁。排除重迭或混合其它嗜肝病毒感染者。病人采血分离血清后于-80℃冰箱内保存备用。 　　1.2主要仪器： IBA 荧光定量扩增仪，由美国ABI公司产品；Allega 25R型高速冷冻离心机，由美国贝克曼公司产品；AU2700全自动生化分析仪，由日本奥林派斯公司产品；I2000免疫发光仪，由美国亚培公司产品； Eppendorf移液器，使用前经过纠正；PCR实验室通过卫生部验收，取得合格资质，操作人员经培训持有上岗证书。 　　1.3实验方法 　　1.3.1 HBV DNA定量测定 采用荧光定量PCR（FQ-PCR）方法，试剂为广州达安技术诊断公司产品，灵敏度为5×102拷贝/ml，其扩增条件为37℃3min，92℃1min；92℃5s，60℃30s，40个循环；40℃10s，1个循环，按说明书操作。 　　1.3.2 HBV标志物检测 病人采用免疫发光法，HBsAg、HBeAg、抗HBe、抗HBc试剂盒由美国Abbott公司提供，按说明书操作与判定，在效期内使用。 　　1.3.3肝功能检测 采用全自动生化分析仪法，全套检测试剂由日本奥林派斯提供。 　　1.3.4 HBV大蛋白测定（LHBs） 采用ELISA定量法， 试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供，在效期内使用。 　　1.3.5 HBV Pre S1测定 采用ELISA法， 试剂盒由上海复星长征医学有限公司提供，在效期内使用。 　　1.3.6统计学处理 X2检验采用SPSS11.0统计软件进行分析。 　　1.3.7结果判定 HBV-DNA检测下限为5×102拷贝/mL，小于1×103拷贝/mL视为HBV DNA阴性；LHBs检测临界值定义为吸光度值（A值）0.105，约相当于1ng/μl，低于检测下限A值按照临界值半数计算。 　　1.3.8乙肝基因分型 采用基因芯片法，试剂由中科院上海微系统与信息技术研究所研制，宁波瑞心生物科技有限公司提供，在效期内使用。操作严格按说明书进行。先进行样本处理→PCR扩增共2次（第一次扩增：940C 4 min后进行35个循环940C 30s，530C 30 s，720C 30 s，最后720C 4 min。第二次扩增：940C 4 min后进行35个循环940C 30 s，560C 30 s，720C 30s，最后720C 4 min。反应产物于40C冰箱保存备用）→芯片