基于位点特异性PCR黄芪与红芪鉴别方法研究.docVIP

基于位点特异性PCR黄芪与红芪鉴别方法研究 　　[摘要] 研究黄芪与红芪药材之间的DNA分子鉴别方法。采集不同产地的黄芪药材30份、红芪28份，所有样品进行总DNA的提取，通过对黄芪及红芪药材 trn L-trn F片段进行扩增、测序，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。并对位点特异性PCR方法进行条件优化。通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增，发现黄芪可扩增出136 bp 片段，红芪可以扩增出323 bp片段。黄芪中掺入10% 以上红芪可以扩增出红芪特异鉴别条带。通过位点特异性PCR的方法实现了黄芪与红芪药材的快速、准确鉴别。 　　[关键词] 黄芪；位点特异性PCR；分子鉴定 　　[收稿日期] 2013-03-07 　　[基金项目] 国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BA128B02）；中医药行业科研专项 （201107009）；包头科技发展项目（2011X1002） 　　[通信作者] * 李旻辉，博士，教授，主要从事蒙药分子鉴定与资源保护研究，Tel： （010）2956， E-mail： li_minhui@；* 周立社，教授，主要从事分子生物学研究，Tel： E-mail： zhoulishe@ 临床常用中药黄芪是豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao或 膜荚黄芪 A. membranaceus （Fisch.） Bge的干燥根[1]。始载于《神农本草经》，传统中医药理论认为黄芪， 性味甘、微温，具有补气固表、利水生津、托毒排脓、生肌等功效[1]。现代医学研究表明黄芪有强心、利尿、降压、抗菌、提高机体免疫功能和促进新陈代谢等作用[2-3]。由于近几年黄芪有效成分的深入研究，作为药食两用的黄芪资源得到了广泛的开发和利用，使得市场对黄芪资源的需求急剧增加。市场上除了正品黄芪外，尚有代用品、伪品和混淆品。而在中医临床用药中，黄芪和红芪通常混用并相互替代，其中红芪是豆科植物多序岩黄芪 Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. 的干燥根，其根茎在外形上与黄芪极为相近，但是质量差异较大。因此，建立一种用于快速、准确鉴别黄芪药材的方法对于保障人民用药安全意义重大。 　　黄芪药材鉴别的方法较多， 鉴定手段也从原植物鉴别、性状鉴别、显微鉴定发展到应用色谱、光谱技术[4-6]。而对于黄芪与红芪的鉴别方法，有显微和色谱的方法曾被报道过[4，7]。目前市面上销售的黄芪多为加工过的药材， 而加工过的红芪药材或其伪品的表面性状、显微特征等与黄芪药材都较为相似[4-5，8]，在实际运用中要进行准确鉴别存在一定难度。同时应用形态学和组织学等方法来鉴定黄芪存在主观性较大、特异性不强、通用性差、对观察者经验的要求高等缺陷，不利于规范化、标准化方法的建立及普及。而DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点，近几年分子生物学中该技术的研究则为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。对于黄芪分子鉴别方面，张曦等对中药材黄芪进行了DNA指纹图谱鉴别研究[9]，而前期课题组已经通过ITS序列差异分析对黄芪及其红芪等混伪品的遗传关系作初步的研究[10]，为了寻找更快速、准确、稳定的分子鉴别方法，对位点特异性PCR方法进行了研究。目前位点特异性PCR方法已成功用于中药材鉴定等方面的研究，如金银花、人参、陈皮等中药材的真伪鉴别[11-13]，因此本研究通过位点特异性PCR方法对黄芪及其混伪品红芪进行研究，为准确进行黄芪与其混伪品的鉴别提供科学的客观依据。 　　1 材料 　　2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），DNA Taq 聚合酶（Takara公司），2 000 bp DNA Markar（Takara公司），三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇均为国产分析纯。 　　PCR仪（德国Eppendorf， 型号5332），电泳系统（北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（德国Eppendorf， 型号5810R），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene， 型号GBOXHR），混合型球磨仪（德国Retsch，型号MM400），数控超声波清洗器（型号KQ-500DE），微量移液器（德国Eppendorf）。 　　本实验选取58份材料包括采自内蒙古的黄芪18份；采自山西的黄芪5份；采自甘肃的黄芪5份；红芪28份，分别采自内蒙古和甘肃；以及2批购自市场上的黄芪药材。凭证标本保存于内蒙古科技大学包头医学院。名称﹑采集地点﹑序列号见表1。 　　表1 材料信息 　　Table 1 T