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抗原特异性Th17细胞分化与调节 　　摘要：目的： 探讨影响抗原特异性Th17细胞分化和调节的因素。方法： T细胞受体转基因小鼠（DO11.10）CD4+T细胞， 与同背景正常小鼠的脾细胞混合， 经OVA多肽刺激后， 在不同的Th17极化的培养条件下， 观察Th17细胞及细胞因子的产生。 结果： 单纯OVA抗原刺激主要诱导特异性Th1型反应， 在TGFβ和IL6存在的条件下， 主要诱导Th17反应； 当加入IL23之后， 促进了Th17细胞的分化。阻断了IFNγ和IL4之后， Th17细胞的百分率明显增加。LPS可以促进Th1型细胞因子的产生， 但对抗原特异性Th17细胞的分化没有明显的促进作用。结论： 抗原特异性Th17细胞是与Th1、 Th2相对独立的细胞亚群， TGFβ、 IL6和 IL23可诱导或促进Th17的分化， 而Th1和Th2细胞因子抑制其分化。 　　关键字：Th17T细胞亚群流式细胞术细胞因子 　　按照CD4+T细胞分化和功能特征可以将其分为Th1和Th2细胞[1]。Th1型细胞通过分泌干扰素γ（IFNγ）等细胞因子介导细胞免疫； Th2型细胞通过分泌IL4等细胞因子介导体液免疫[2， 3]。Th1型免疫反应失调， 出现组织损坏和慢性炎症， 而Th2型免疫反应失调， 则导致过敏和哮喘疾病的发生[3]。近年来， 在类风湿关节炎、 实验性自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫病和过敏原特异性反应研究中发现一种特殊的辅助型T细胞。这群CD4+T细胞同传统Th1和Th2细胞具有明显不同的特征： 主要分泌IL17， 表达控制其分化的独特的转录因子――孤独受体（orphan nuclear receptor， RORγt）[4]， 因此命名为Th17细胞。目前对于此细胞亚群的研究主要集中于其在疾病的发生发展中的作用， 而探讨影响抗原特异性Th17细胞的诱导和分化因素的报道较少。为此， 我们研究了体外培养体系中， 初始抗原特异性TCRTg CD4+T细胞， 经抗原刺激后， 探讨影响Th17细胞的诱导、 分化和调节的因素。为深入研究CD4+T细胞免疫调节效应和探讨自体免疫性疾病等免疫学机制提供实验和科学依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 OVA抗原特异性转基因BALB/c小鼠（DO11.10， TCRTg， 雌性， 6～8周龄）， 购自实验动物中心。PerCP标记的抗CD4（PerCPCD4）、 APC标记的抗IFNγ（APCIFNγ）、 PE标记的抗IL17（PEIL17）均购自美国BD/Pharmingen公司。FITC标记的抗KJ1.26单克隆抗体（mAb） 特异性识别转基因OVA抗原受体表达的细胞， 购自Caltag Laboratories（CA）。Recombinant Murine IL6、 human IL2和TGFβ购自PEPROTECH公司。LPS和布雷菲德菌素（brefeldin A， BFA）购自Sigma公司。antiIFNγ和antiIL4购自BioLegend公司。IL2、 IFNγ ELISA kit和 FACS Calibur流式细胞检测仪购自BD公司。Mouse IL23、 IL4和IL17 ELISA kit购自RD公司。RPMI1640培养液购自Gibco公司。小鼠淋巴细胞分离液购自达科为公司。ELX 800 Universal Microplate Reader酶联免疫检测仪购自BioTEK instrument.INC德国。 　　1.2 方法 　　1.2.1 TCRTg BALB/c小鼠单个细胞的制备 简言之， 取小鼠的脾脏， 研磨， 筛网过滤， 然后经小鼠淋巴细胞分离液密度梯度离心（800 r/min， 30 min）， 收取单个核淋巴细胞， 计数， 用RPMI1640培养液（含100 mL/L灭活胎牛血清、 50 g/L谷胺酰胺、 100 U/mL青霉素、 100 mg/L链霉素、 50 mol/L2ME）调整细胞密度为3×109/L。 　　1.2.2 细胞培养 新鲜分离的DO11.10小鼠单个核细胞与同背景BALB/c小鼠单个核细胞悬液按1∶4比例混合， 在有/无OVA多肽（OVA 323339， 1 mg/L）、 相应细胞因子（TGFβ 1 μg/L、 IL610 μg/L、 IL23 10 μg/L或抗细胞因子抗体αIFNγ5 mg/L、 αIL45 mg/L）不同组合的情况下培养4 d后， 新鲜RPMI1640培养液中加入低剂量IL2（10 U/mL）继续培养2 d， 收集细胞， 加入OVA多肽和αCD28 （终浓度1 mg/L）， 刺激的第1 h后， 加入BFA继续培养4 h， 用于细胞内细胞因子染色。 　　1.2.3 ELISA检测 培养4 d的