细胞工程读书报告-胚胎分割技术.docVIP

胚胎分割技术的简述 胚胎分割（Embryo bisection）是指借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。由于来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此 胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一【1】。胚胎分割技术可用于扩增可用的优良胚胎的数目和生产同卵双胎、同卵多胎的克隆动物，可用于濒危动物的保护，也可为早期胚胎遗传疾病的检查和性别鉴定等技术提供一种活 体组织检查的方法。 胚胎分割的研究概况 早在1904年，Spemann就进行了蛙类2细胞胚胎的分割实验，并获得同卵双生后代。20世纪30年代，Pincus等首次证明2细胞兔胚的单个卵裂球在假孕受体兔体内可发育为体积较小的胚泡。哺乳动物胚胎分割技术始于Nicholas( 1942) 对大鼠22细胞胚胎卵裂球的分离和培养研究。其后,1959 年Tarkow ski【 2 】研究了小鼠1/4 ,2/4 ,3/4 卵裂球的发育规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来，随着胚胎培养及移植技术的发展和完善，哺乳动物胚胎分割取得了突破性进展。1979年，Willadsen等通过分离2细胞胚胎的卵裂球，也获得绵羊同卵双生后代。20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术进人快速发展时期。1998 年,Rho 等【3】又利用卵母细胞体外培养成熟、体外受精的方法获得了牛胚胎,移植12 枚四分胚给6 头受体,获得2 头四分胚的犊牛,这是第一次利 用体外胚分割得到活体后代。当然,胚胎并不是随着分割次数的增加,产生的克隆动物就越多。如果超过四分割以上则产生的克隆动物个体数可能反而减少,甚至一个也得不到。为了使胚胎分割技术更便于在生产中推广应用,一些学者开始对这种显微操作技术加以改进,简化其方法并避免使用昂贵仪器,而采用在体视显微镜下徒手操作的简易方法进行胚胎分割。1988 年Williams 用止血钳夹住用刮胡刀片制成的显微手术刀片分割7龄牛胚得到了同卵双生牛犊【4】。 我国家畜胚胎分割及相关的研究工作，自20世纪80年代晚期以后进展也很快。1986 年窦忠英等【5】得到了国内首批分割胚牛犊(单生) ,该实验将分割所得的半胚装入透明带后移植受体与裸胚直接移植受体的产仔率均为25 %。谭丽玲等（1988年）对兔胚胎进行了半胚分割，并获得仔兔【6】。1989年，江苏农科院、中科院遗传所获得山羊鲜胚分割羔羊；同年，张涌等也获得了山羊鲜胚和冻胚分割羔羊；此外，我国的研究人员也把胚胎分割与胚胎性别鉴定有机结合，推动了胚胎分割的深人研究和推广。 二、胚胎分割原理 早期实验胚胎学的研究发现,大多数哺乳动物的胚胎发育是调整发育,即去掉一个早期胚胎的一半,剩余的部分可以调整其发育方向,仍可以发育为一个完整的胚胎。反之,若把两个早期胚胎融合在一起,它们不是发育为两个连在一起的胚胎,而是在细胞间重新调整,仍发育为一个胚胎。但随着发育进程,其调整能力逐渐减弱,细胞的组织发育方向变得越来越固定,直到调整能力完全丧失。 早期的实验胚胎学证明哺乳动物2细胞期的每个卵裂球都具有发育为正常胎儿的“全能性”。对小鼠胚胎分割的实验认为,在32 细胞期的胚胎仍具有调整能力,但到64 细胞期的胚胎就逐渐失去这种能力。到神经轴时期的胚胎,再分割为两半,就永远不会发育为正常的胚胎了【4】。 三、胚胎分割方法 1、毛细管吹吸法 该方法主要适用于分离2细胞到8细胞期卵裂球。在显微操作仪的帮助下,在无钙、镁离子的培养液中,用固定针吸住胚胎,用另一玻璃针挑开胚胎的透明带,细胞团自透明带中脱出。再用仅能通过胚胎的毛细管吹吸胚胎,得到单个卵裂球,再将卵裂球装入空的透明带中,体外培养至一定时期,移植入受体中。 2、徒手分割法 该法主要适用于分割体积较大的胚胎,其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下,用止血钳夹住切割刀片,将透明带切开一部分,再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次,胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑葚胚和囊胚。 3、显微手术法 这种方法主要适用于分割桑堪胚和囊胚。在显微操作仪的帮助下,以固定针吸住胚胎,用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。在切割桑葚胚时,需要在不含钙、镁离子的培养液中,以降低细胞间的连接,降低由于切割造成的损伤。对胚胎的分割要注意对称,尤其是囊胚,要注意将内细胞团对称地一分为二。但这种方法与徒手分割相比无论切割有效率还是移植产羔率都是最低的。并且玻璃针带内切割需要昂贵的显微操作系统,因此这种切割方法在实践中很难得到推广应用【7】。 4、酶消化法去透明带后分割法 5、免疫手术法 四、胚胎分割操作流程 胚胎分割可在哺乳动物2细胞期至胚泡