儿科常见疱疹类毒分子诊断及其临床应用.pptVIP

（二）、研究内容、研究目标、拟解决的问题和今后研究思路 1、研究内容基础部分 （1）、以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标，经计算机查索核酸序列库，选取保守DNA区域设计引物，建立能扩增所有6-8种疱疹类病毒的PCR方法。对标准毒株HSVⅠ（F株）、HSVⅡ（G株）、CMV（169株）、EBV（B95-8株）、VZV（EF株），以及HHV6（GS株）进行PCR扩增，并选择其他病毒如HBV、细菌（大肠杆菌、金葡菌等）、真菌（新型隐球菌）作为对照，以摸索出进行通用引物PCR所需的最小检出量，及其各自反应体系的适宜条件。 （2）、在疱疹类病毒的可变区域设计特异性引物，建立扩增对各自特异病毒DNA的PCR方法，包括CMV、HSV、EBV、VZV、HHV6、HHV7、HHV8等的PCR方法。并比较各自特异PCR方法与通用引物PCR检测标准毒株其敏感性、准确性等方面的差异。 （3）、经核酸序列GenBank比较，设计各自特异的DNA探针，并进一步分子克隆、序列分析，明确HSV、HHV6的亚型基因，设计HSVⅠ/Ⅱ、HHV6A/6B等的特异性探针。 （4）、对设计的DNA探针末端修饰，微阵列，制作基因芯片。内容包括固相载体的选择、玻片表面修饰、探针末端修饰、微阵列制备技术、核酸探针的固定及杂交。 （5）、基因芯片杂交系统参数的确定及检测，包括DNA固液相杂交、荧光标记与检测方法，灵敏度及特异性测定等。 2、研究内容临床部分 我院临床有中枢神经系统感染，包括急性、散发性、局灶性脑炎，脑膜脑炎等患儿，收取脑脊液及外周静脉血，对全身不明原因发热、皮疹、黄疸、肝脾肿大等患儿抽取静脉血，进行DNA抽提、PCR扩增，阳性结果进一步进行基因芯片分析。 同时对临床标本血清（血浆）进行HSV、EBV、CMV等的特异性IgM、IgG检测。试图调查儿童疱疹病毒感染的实际情况，研究儿童病毒感染的早期诊断价值，发现特定疱疹病毒感染或混合感染情况，以阐明PCR-基因芯片在诊断及区分不同病毒感染时的实际意义。 在研究过程中，同时设立健康体检儿童的对照组及非病毒感染的脑脊液标本，进行PCR-基因芯片检测，以排除假阳性、假阴性等情况，拟在解决目前病毒感染缺乏早期、快速、准确诊断的问题。 3、研究目标 在疱疹类病毒高度同源序列的DNA多聚酶基因内设计通用引物扩增所有疱疹类病毒DNA，对其PCR扩增产物进行分子克隆、序列测定，通过序列分析找到各自特异的DNA序列及亚型序列，设计特异探针，建立疱疹病毒DNA基因芯片区分不同病毒感染，为临床疱疹类病毒感染的早期、快速诊断提供有效手段。 4、拟解决的问题 （1）、在疱疹病毒的高度同源序列选择通用引物，建立能检测CMV、HSV、VZV、HHV等所有疱疹类病毒的PCR方法。 （2）、在疱疹病毒的可变区选择特异DNA探针，并对HSVⅠ型与Ⅱ型、HHV6A与HHV6B等亚型进行分子克隆、序列分析，找到各自特异DNA序列，建立基因芯片，区分不同疱疹病毒及其亚型。 5、今后研究思路 * * 儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用磐安县人民医院 申屠桥民 一、儿科常见疱疹类病毒感染的病原体种类、危害及诊治现状 1、儿科常见疱疹类病毒感染现状 全世界每年有1300万因感染性疾病而死亡，其中1000万是5岁以下儿童，99%发生在经济欠发达的发展中国家，其死因的70%是因常见的感染性疾病引起。 随着科技水平的不断提高，各种抗生素、抗病毒药物日益增多，若能早期快速明确诊断系何种病原体感染，就能有效地控制儿童的病死率。然而，目前感染诊断在我国还局限于生化、培养、病原体分离等常规方法，缺乏早期、快速、准确诊断的方法 在常见感染性疾病中，细菌与病毒共占了90%以上（其中细菌与病毒各占45%左右）。在95重大攻关项目中，成功地创建了16SrRNA基因PCR—基因芯片快速、准确诊断不同细菌的感染，使细菌诊断上了一新的台阶，其研究成果也列入了全国新生儿败血症诊断标准。 但病毒的快速早期诊断方法仍未见报道。儿童是祖国的未来，如何早期明确诊断儿童病毒感染将是能否治愈病毒感染的关键。 2 、儿科疱疹类病毒感染的危害 儿童病毒感染造成严重危害涉及儿科与围产医学二大范畴。儿科领域中，病毒感染致死的主要原因是中枢神经系统感染，典型的感染为单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSVⅠ）所致的脑膜脑炎（HSE）。 HSE是散发性病毒性脑炎中最常见的病原。其次表现为发热、肝脾淋巴结肿大等原因不明的病毒感染，最具代表性的疾病是传染性单核细胞增多症。目前已知主要是由于EB病毒感染所致。EB病毒还对神经系统危害严重，如引起脑膜脑炎、格林巴利综合症、Fisher’s综合症等。 在围产医学中，病毒感染的危害在于宫内感染，最具典型的是巨细胞病毒（CMV），其次是单纯疱疹