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利用高效液相色谱指纹图谱进行半夏药材鉴别 殷红莲? 李正国* 杨迎伍 王国民 段伟 （重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6×250 mm）1 mL·min-1 ；检测波长254 nm。结果 以鸟苷为参考，利用色谱峰的相对保留时间与峰面积对其进行技术参数评价建立了半夏高效液相色谱指纹图谱，将其中9个色谱峰作为半夏药材与半夏伪品、替用品的鉴别峰群。结论 所建立的半夏高效液相色谱指纹图谱，为半夏药材真伪鉴别提供了有效的方法参考。 关键词 半夏，高效液相色谱，指纹图谱，鉴别 半夏[Pinellia ternata (Thunb) Breit]为天南星科多年生草本植物，以块茎入药，是一种重要的中药材，而在中国民间作为半夏使用的半夏属植物有5种(掌叶半夏滴水珠盾叶半夏大半夏五叶半夏)，除半夏属植物外还有多达12种的同科植物作半夏使用。半夏实际用中混乱TEDIA公司），其它试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 高效液相色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18 （5 μm，4.6×250 mm）色谱柱；采用梯度洗脱二元流动相，A液为超纯水，B液为95％甲醇（体积分数），流速1 mL/min ；柱温30℃；检测波长254 nm；进样量20 μL。 2.2 样品的收集与前处理 半夏样品及其常见的替用品和伪品的来源见表1。将样品于60℃烘箱中烘干2 h，粉碎，过40目筛，置瓶中密封保存备用。精确称取药材粉末1.0 g，置50 ml具塞三角瓶中，加20 ml超纯水浸提0.5 h后，超声提取40 min，冷冻干燥成粉末，用2 ml超纯水充分溶解，微孔滤膜过滤，得样品溶液并4℃低温保存，供进样检测。 表1 半夏药材来源及其替用品和伪品 Table 1. The origins of P. ternata., and the samples of its succedaneums and shoddies Sample Origin Sample Origin Sample Species Ⅰ Shapingba district Chongqing Ⅴ Sichuan Province Ⅸ Typhonium flagelliforme Ⅱ Xuanhan county Sichuan Province Ⅵ Gaoan town Chongqing Ⅹ shoddy of P. ternata. Ⅲ Shahe town Chongqing Ⅶ Xinjiang county Shanxi Province Ⅺ Pinellia pedatisecta Ⅳ Gaomi county Shandong Province Ⅷ not identified Ⅻ P. ternata.of tissue culture 2.3 测定波长的选择 利用分光光度计优化供试样品溶液最佳检测波长，扫描范围为200～400 nm。结果发现在250-260 nm处吸收峰最强、峰阈宽。因此，确定半夏提取液的最佳检测波长为254 nm。 2.4 标准对照品试验 精确称取鸟苷标准品10 mg，超纯水溶解，定容50 ml，得标准品溶液。取标准品溶液20 μl进行高相液相色谱分析，在25.48 min出现单峰，可确定该峰为鸟苷标准品峰。将鸟苷标准品溶液与样品溶液以1:1的比例混合后，取20 μl进行高相液相色谱分析，在25.438 min的峰都有重叠，确定鸟苷峰在该色谱系统中的保留时间为25.4 min，并可作为半夏成分的1个参考指标[2]。 2.5 方法学考察 以四川宣汉半夏为供试品溶液，进行色谱系统试验发现，供试溶液在48h内稳定性较好，共有峰的相对保留时间和峰面积的相对标准偏差RSD均小于3%；连续5次试验，共有峰的相对保留时间和峰面积的比值相对标准偏差RSD均小于2%；取同一批供试品5份，共有峰的相对保留时间和峰面积的比值相对标准偏差RSD均小于3%。上述相对标准偏差试验结果表明供试品溶液的稳定性、精密度、重现性均符合指纹图谱实验的要求。 2.6 色谱指纹图谱重叠率 按文献[3]的色谱指纹图谱重叠率公式：重叠率(%)=[2×(待测样品与标准样品共有峰)/(待测样品峰数+标准样品峰数)]×100%进行。 3结果 3.1半夏药材样品HPLC指纹图谱 按2.2方法制备供试品溶液，分别取12个不同产地的半夏药材样品及其替用品和伪品的溶液20 μl，通过HPLC分析其指纹图谱。对12个不同产地的半夏及其伪品的HPLC色谱图进行比较发现有21个主要色谱峰，结果见图1。 图1 半夏药材样品HPLC指纹图谱 Fig.1 HPLC fingerprint of P