實驗五微生物培養與分離技術.docVIP

實驗九 微生物生長曲線之測定 一、目的:學習測定微生物的生長曲線，並以吸光度計測出吸光值和計算菌數繪出微生物生長曲線，瞭解微生物生長曲線的四個時期。 二、原理 微生物生需要提供適當的營養物質與環境條件，微生物生長包括微生物細胞增大或增重以及整個微生物族群的增加。學者為了瞭解為生物生長情形、生理特性與培養特徵，必須進行微生物生長測定，其測定方法包括檢測為生物的數量、重量以及特性，而測定為生物族群的生長曲線也為研究為生物生長得重要步驟之一。 測定微生物生長曲線的方法是將待研究之微生物接種於密閉環境下，供給一定的營養物質(培養基) ，並給予最適溫度、pH及需氧氣條件進行培養，培養過程中不再添加任何營養物質，微生物則此條件下逐漸生長，其生長狀況可利用微生物菌數的增加與時間之關係，匯出微生物生長曲線圖。 (一)遲滯期 微生物正適應新環境，細胞吸收養分，代謝加速，並進行生理化反應以合成新細胞組織。此時微生物細胞增大，但未進行分裂，所以數目並沒有明顯變化。 (二)對數期 微生物以適應環境，在充分供營養與良好生理條件下，微生物呈幾何倍數增加至最大數目，曲線呈上升之趨勢。此期之微生物在化學組織、代謝作用或型態上都較其他時期更為一致，因此微生物學家通常以此期進行各項實驗。 (三)穩定期 由於對數期微生物大量繁殖的結果使的密閉環境中的微生物數量大增，產生的毒性代謝產物增多，營養物質大量減少，微生物開始受到生存空間不足、營養物質缺乏與代謝毒性產物增加威脅，其生長已達飽和，此其微生物繁殖速率與死亡速率相等，因此微生物數目不再增加，維持最大數目，生長曲線成平行之趨勢。 (四)死滅期 由於生存空間不足、營養物質消耗殆盡與毒性代謝物產生持續增加，微生物進行內呼吸代謝、自體分解以極快的速率死亡。此其微生物死亡速率遠大於繁殖速率，生長曲線呈下降趨勢。 三、實驗材料及儀器 1.試管 2.試管架 3.玻璃吸管 4.吸球 5.稱藥紙 6.稱藥勺7.酵母菌 8.培養液 9.塑膠滴管 10.錐形瓶 11.燒杯 12.比色管 13.三角彎棒 14.酒精燈 15.試管蓋 16.葡萄糖17.電子天平 18.分光光度計 19.恆溫培養箱 20.恆溫振盪器 四、實驗步驟 1.將分光光度計打開且熱機10分鐘使光度計讀值穩定。 2.取0.5g的酵母粉及1g的葡萄糖粉，再加入50mL培養液，搖晃均勻。 a. 取部份菌液加入比色管(約八分滿)，以分光光度計測 其吸光值(濁度)，波長為595nm。 b. 以塗碟法，測其菌數。取0.1mL菌液滴於培養基正中央，以滅菌之三腳彎棒均勻塗抹。注意:菌液要適當稀釋才可塗碟，否則菌數太多，事後無法推算原液菌數，建議稀釋至10^-4，可自行調整。 3.將菌液瓶置於培養箱震盪培養20分取出瓶子取部份菌亦重複a跟b，並記錄取各個數據。 4.將以塗碟法塗好的培養基倒放過來，放入恆溫器(37度C)裡放置一天並在隔天觀看結果。 5.隔天觀察並計算培養基之菌數，算出菌液之菌數。 五、結果與討論 次數 時間 吸光度值 10^-4菌數 第一次(1) 20分鐘 1.915 345 第二次(2) 20分鐘 1.966 362 第二次(1) 40分鐘 1.965 441 第二次(2) 40分鐘 1.984 398 第三次(1) 60分鐘 1.85 358 第三次(2) 60分鐘 1.86 347 (搖晃20分鐘) 第一次第二次 (搖晃經過40分鐘) 第一次第二次 (搖晃經過60分鐘) 第一次第二次 1.說明各組實驗結果(包刮數據與圖形)之生長曲線進行至那一期？此圖形又何意義？ 我覺得我們做出來的圖有一點像微生物的生長曲線，好像只進行到穩定期。 2.說明各組生長曲線的適應期有多長？為什麼此一時期的吸光值都沒有顯著增加？若此時期所得的吸光值成不規則上下跳動，應該如何解釋？ 對數期的適應長達40分鐘左右，而後面的60分鐘幾乎都已經進入了穩定期了，這一時間的菌數還未有明顯的成長所以吸光值就沒有明顯的增加，應該是有些菌已經成長，而有些菌還未成長，而等到未成長的成長，那些已成長的都已經死亡了，才會呈現上下跳動的數值。 3. 測定微生物的生長曲線在微生物學上有何意義？ 說明微生物的生長過程，在有限的食物之下微生物生長的數目會有何變化，以一開始的遲滯期代表著微生物剛剛到了這個地方對這裡還不適應所以生長的的數目很稀少。 到了對數期，微生物開始大量的生長，在空間足夠和食物充足的情況下大量的生長。 穩定期的階段，空間幾乎都已經滿足了，新生長的微生物和死亡的微生物呈現平衡的情況。 死滅期的階段，在空間不足的和食物不足的情況下，微生物開始大量的死亡，所以造成死滅期的曲線幾乎以垂直的往下掉。 4. 說明分光光度計的測定原理與實驗步驟。 它是以光線射入樣品，若菌