组蛋白赖氨酸去甲基化酶kdm3a特异性磷酸化在热激中对hsp90aa1基因表达的调控-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院博士研究生论文缩写词表bpbase pairBSAbovine serum albuminCDNAcomplementary DNACI皿Chromatin ImmunoprecipitationDEPCdiethyl pyrocarbonateDMSOd曲emyl sulfoxideDNAdeoxyribonucleic aciddNTPdeoxynucleoside triphosphateDTTdithiothreitolEBethidium bromideECLeleclrochemiluminescenceEDTAethylenediamine tetracetic acidGAPDHglyseraldehyde--3·-phosphate dehydrogenase GSTglutathione transferaseHEPESN一2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid HSFHeat shock factormimmunoblottingIFN丫Intell宅roIls gama口immunoprecipitationKanrkanamycin resistancekbl(ilobaseKDkilodaltonLBLuria Bro也PAGEpolyacrylamide gel electrophoresisPBSphosphate buffered salinePCRpolymerase chain reactionPMSFphenylmethyl sulfonyl fluorideRNARibonucleic AcidRNaseAribonuclease Arpmroullds per minutel汀reverse transcriptionSDSsodium dodecyl sulfate3万方数据北京协和医学院博士研究生论文TAEtris．acetic EDTA bufferTBSTTris Bu疵red Saline with TweenTETris．ED翻bufferTEMEDN，N N’，N-tetramethylethylenediamineTmmelting temperature4万方数据北京协和医学院博士研究生论文中文摘要热激应答是生物体对外界高温刺激(广义的还包括冷刺激，化学刺激等等)的 一种生物学应激反应的过程，对生物体适应复杂的外界环境，行使正常的生物学功 能有着非常重要的作用。热激蛋白家族是热激过程中一类能受到特异性调控和诱导 表达的蛋白家族，对热激应答起到了最关键的作用，能通过分子伴侣等形式保护细 胞在复杂环境下存活。组蛋白是一种真核生物细胞中广泛存在的DNA结合蛋白。DNA紧密缠绕在组 蛋白八聚体上。组蛋白对染色质有着非常重要的结构和功能意义。组蛋白赖氨酸残 基可以发生乙酰化或者甲基化等修饰，这些修饰可以通过空间或电荷效应影响基因 转录，而组蛋白H3上第九位赖氨酸上的二、三甲基化则一般与转录抑制过程有关。 KDM3A(又名JHDM2A或者JMJDlA)是一种能特异催化去除H3K9mel／2修饰的去 甲基化酶。KDM3A已知能参与精子发生、能量代谢、细胞分化、细胞癌变等生物 学过程中，但其调控的机制和原理知之甚少。在本课题组之前的研究中发现，热激 能激活的部分热激蛋白基因在与热激相似的1，干扰素(IFNT)刺激下不能激活，而这种不同存在细胞特异性，这种差异调控的机制值得进一步研究。本课题研究结果中，检测到人外周血白血病淋巴T细胞细胞系Jurkat在热激条 件下HSP90AAl(hsp90a)等基因表达增加，进一步使用转录组测序分析了热激前后 Jurkat细胞转录组的变化，找出了表达显著变化的基因群并分析了其功能聚类情况，统计了多种热激蛋白在RNA水平表达变化情况。通过染色质免疫共沉淀(Cm)等研究发现热激中HSP90AAl基因启动子区会发生组蛋白H3上第九位赖氨酸的二 甲基化修饰的减少，进一步研究发现组蛋白去甲基化酶KDM3A参与到此过程中， 能在热激中结合到靶基因调控区发挥催化活性。免疫共沉淀、功能缺失突变和敲低 实验以及体外磷酸化等实验结果表明蛋白激酶MSKl能特异性的在热激条件下磷酸化KDM3A的264位丝氨酸。制备此位点特异性磷酸化抗体后，通过ChIP．seq研 究发现264位丝氨酸磷酸化的KDM3A高度富集于基因调控区，可能参与数种热激 蛋白基因在热激中转录活化的过程，且其富集区域统计偏好碱基序列与转录因子 STATl的偏好性最为相似。进一步通过免疫共沉淀证明了磷酸化KDM3A在热激中 与STATl相互作用且KDM3A磷酸化是相互作用关键因素，通过删切实验找出了相互作用区域。干扰STATl后检测KD