装载不同功能rna的重组ms2病毒样颗粒的原核表达及应用研究-临床检验诊断学专业论文.docx

北京协和医学院博士学位论文2．3．1．琼脂糖凝胶电泳鉴定重组病毒样颗粒．332．3．2．SDS．PAGE鉴定重组病毒样颗粒．332．3．3．RT．PCR鉴定重组病毒样颗粒内含目的RNA序列342．3．4．商业化试剂盒验证VLPs包装片段．342．4．以重组病毒样颗粒作为样本的室间质量评价362．4．1．样本盘的建立362．4．2样本盘的稳定性实验．362．4．3．室间质量评价结果373．讨{仑．．40第二部分表面展示细胞穿透肽TAT的重组MS2病毒样颗粒miR．122递送载体的制备及其肝癌治疗效果的研究46前言461．材料和方法．．491．1．实验材料和试剂配制491．1．1．仪器．．491．1．2．菌株、细胞系和质粒501．1．3．主要实验耗材511．1．4．主要实验试剂521．1．5．溶液的配制541．2．方法．．581．2．1．表面展示TAT的重组病毒样颗粒miR．122递送载体的构建．581．2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化．611．2．3．重组病毒样颗粒的鉴定．631．2．4．内含pre．miRl22表面展示TAT的重组病毒样颗粒的FITC荧光素标记及穿膜能力验i正．631．2．5．表面展示TAT的重组病毒样颗粒处理细胞后miR．122水平变化的检测641．2．6．MS．miRl22VLP及MS．miRNCVLP化学交联TAT穿透肽681．2．7．表面展示TAT的重组病毒样颗粒与化学交联TAT的病毒样颗粒细胞毒性验证．691．2．8光学显微镜下观察表面展示及化学交联TAT的重组病毒样颗粒介导的miR一122(miRNC)处理后细胞形态学变化70万方数据北京协和医学院博士学位论文1．2．9Transwell小室观察内含miRNA的重组VLPs处理后细胞迁移及侵袭能力711．2．10．流式细胞术检测内含miRNA的重组MS2VLPs处理后细胞凋亡情况721．2．11．WesternBlot验证内含pre．miRl22的VLPs处理细胞对靶蛋白的抑制情况．721．2．12．裸鼠接种人肝癌细胞建立动物模型741．2．13．动物模型分组及给药．．751．2．14．给药后各实验组小鼠CT拍摄751．2．15．小鼠取瘤测量大小．．751．2．16．动物WB检测靶蛋白抑制情况．．751．2．17．HE染色检测各处理组小鼠动物模型肿瘤生长情况．761．2．18．免疫组化方法检测各处理组小鼠动物模型肿瘤生长情况761．2．19．统计学分析．．772．结果．．772．1．重组病毒样颗粒的表达和纯化772．1．1．丙烯葡聚糖凝胶层析纯化重组病毒样颗粒．772．1．2．重组MS2VLPs的蛋白定量．792．2．表面展示n盯重组病毒样颗粒的鉴定．．792．2．1．SDS电泳鉴定表面展示TAT的重组病毒样颗粒792．2．2．电子显微镜鉴定重组病毒样颗粒．802．3．表面展示TAT的重组病毒样颗粒穿膜能力验证．．822．4．表面展示TAT的重组病毒样颗粒处理细胞后miR．122水平变化情况．．832．4．1．表面展示TAT的重组病毒样颗粒不同浓度、处理不同细胞系后miR．122水平变化情况．832．4．2．表面展示TAT的重组病毒样颗粒处理Hep3B细胞后miR．122水平变化与时间的关秀；．．842．5MS．miRl22VLPs化学交联TAT后SDS验证852．6．重组病毒样颗粒的细胞毒性及增殖实验852．7．光学显微镜下观察重组病毒样颗粒处理后细胞形态学变化882．8．Transwell小室验证重组病毒样颗粒处理细胞效果902．8．1．重组病毒样颗粒处理细胞后迁移性实验验证．902．8．2．重组病毒样颗粒处理细胞后侵袭性实验验证．91万方数据北京协和医学院博士学位论文2．9．重组MS2VLP处理后流式细胞术检测细胞凋亡．922．10．重组MS2VLP处理后WesternBlot验证靶蛋白抑制情况972．11．重组病毒样颗粒处理裸鼠肝癌模型肿瘤大小情况．．992．12．重组病毒样颗粒处理裸鼠肝癌模型肿瘤CT结果．1002．13．重组病毒样颗粒处理裸鼠肝癌模型肿瘤增长曲线1012．14．重组病毒样颗粒处理裸鼠肝癌模型肿瘤WB检测结果1032．15．重组病毒样颗粒处理裸鼠肝癌模型肿瘤HE染色结果1032．16．重组病毒样颗粒处理裸鼠肝癌模型肿瘤免疫组化结果1053．讨{仑106论文综述．114埃博拉出血热的早期诊断及病毒核酸的快速检测方法．．114附录123附录1：pACYCDuet．1载体详细信息123附录2：表达载体pACYC—MS2-NP、pACYC．MS2一GP／L序列比对结果．．125附录3：p2MS2-TAT—miR一122、pMS．miRl22重组质粒比对结果．138致谢．143个人简介．145北京协和医学院博士学位论文英文缩略词英文