转录因子slug对人前列腺癌细胞生长和转移的影响-外科学专业论文.docx

博士学位论文转录因子Slug对人前列腺癌细胞生长和转移的影响 中文摘要目的：通过对人前列腺癌细胞系PC一3、LNCaP、DU-145、22RVI的体外及体内实 验，探讨前列腺癌细胞Slug的表达情况，以及Slug通过对细胞周期调节因子 Cycl in D1的调控影响前列腺癌细胞的生长，及Slug对前列腺癌细胞转移的影 响。从而认为Slug可以做为一种新颖的治疗手段以预防和延缓前列腺癌的的进 展。材料和方法：体外培养前列腺癌细胞系PC-3、LNCaP、DU一145、22RVl；构建质粒pMIGW— Cycl in D1一HA和质粒pMIGW—Cyl in D1一HA T286A；SDS—PAGE及Western Blot 检测Slug、Cyclin D1、Cyclin D2、HA、Q—Tubulin、B—actin蛋白的表 达；利用表达Slug、Cyclin D卜HA、Cylin D1一HA T286A以及其空白对照的 pMIG载体制备逆转录病毒(retrovirus)，用表达Slug—shRNA以及其空白对 照的pLKO．1载体制备慢病毒(1entivirus)，并用制备的病毒感染PC一3和 DU一145细胞系；提取前列腺癌细胞的所有RNA，并逆转录成cDNA；RT—PeR和 Real—Time PCR检测Snaill、Snail2／Slug、Snail3、Scratchl、Scratch2、 Cyclin D1 mRNA的表达。流式细胞仪分别检测经过碘化丙锭(PI)染色的含有pMIGRI载体以及 pMIGRI—Slug载体的两种PC一3细胞系的DNA含量进而分析其细胞周期的变化； 用MTT法分别检测含有pMIGRI载体以及pMIGRI—Slug载体的两种PC一3细胞系 的体外生长情况，用快速细胞增殖法分别检测含有pMIGRI载体、pMIGRI—Slug 载体、pMIGW-Cylcin D卜HA载体的两三种PC-3细胞系以及含有pLKO．1载体和 pLKO．1一shSlug载体的两种DU一145细胞系的体外生长情况；把含有pMIGRI载 体以及pMIGRI-Slug载体的两种PC-3细胞系分别注入NCR—nu／nu裸鼠的左右背 部皮下构建体内肿瘤模型，从而检测两种细胞系在体内的生长情况。DU一145细胞系分别加入O u l、10 u 1、20 u 1、40 u l表达人Slug 的腺病毒，4天后Western Blot检测Slug、Cyclin D1蛋白表达变化，Real— Time PCR检测Slug、Cycl in D1 mRNA表达变化。在含有pMIGW—Cycl in D1一HA 载体和pMIGW-Cylin DI-HA T286A载体的两种PC一3细胞系中分别加入0u l、40 u l、80 u l、120 la l表达人Slug的腺病毒，5天后Western Blot检测Slug、Cyelin D1蛋白表达变化；在含有pMIGW—Cyclin D1一HA载体 和用0．1 1．1 M／L MG一132(泛素化信号通路抑制剂)处理的含有pMIGW—Cylin D1一 HA载体的PC一3细胞系中分别加入30 u 1、60 u l表达人Slug的腺病毒，31博士学位论文转录因子Slug对人前列腺癌纽胞生长和转移的影响 天后Western Blot检测Cyclin DI蛋白表达变化；免疫共沉淀法检测转染了pMIGW—Slug—HA载体的U20S细胞中Slug蛋白和Cyclin D1蛋白的结合；免疫 荧光双重染色激光扫描共聚焦显微镜技术检测同时转染pcDNA—Cyclin DI—HA 载体和pMIGW—S1ug—GFP载体的U20S细胞系中Slug蛋白和Cyclin D1蛋白的 结合情况。划痕试验和基底膜基质试验检测含有pMIGRI载体以及pMIGRI—Slug载体的 两种PC一3细胞系的体外侵袭能力。结果：与野生型小鼠的前列腺组织蛋白样品相比，转基因小鼠前列腺癌 (TRAMP)模型的前列腺癌组织蛋白样品Slug蛋白表达量升高。Slug蛋白在 PC一3、LNCaP、22RVl三种人前列腺癌细胞系中呈高表达，其中在LNCaP中的表 达量最高，PC-3、22RVl次之。而在DU一145中的表达量最低。在Snaill、Snai 12／Slug、Snail3、Scratchl、Scratch2五个Slug／Snail超级家族成员 中，只有Slug在四种前列腺癌细胞系中的转录水平较为明显，且各细胞之间的 表达量存在明显的差异(PO．05)，其中在PC-3细胞系中的转录水平最高、DU-145、LNCaP次之，在22RVl细胞系中的转录水平最低。Slug在四种前列腺 癌细胞系中的蛋白水平与转录水平无相关性。Slug的表达量与p