转基因棉花中外源基因的检测及盐胁迫条件下基因的表达分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

浙江理工大学硕士学位论文摘要随着转基因作物产业化进程的推进，越来越多的转基因作物进入食品和医药领域，因此建立快速有效的检测技术已成为世界各国转基因授权评估机构所面临的巨大挑战。本论文利用多重PCR和微流体芯片技术建立转基因棉花外源基因的检测体系。该体系通过多重PCR技术高通量扩增棉花外源基因的同时运用微流体芯片对反应产物进行特异性地检测。本论文根据转基因数据库中绝大多数植物的外源基因序列设计探针1032条，制备具有筛选基因、目的基因、交联结构序列、特异性结构序列和16种经济作物种属内参基因的综合性基因芯片。多重PCR技术的关键在于多重PCR反应条件的优化，本文从多重引物组合、PCR反应体系、PCR反应条件这三个方面对转基因棉花多重PCR反应进行优化，建立了扩增效率较高的转基因棉花中棉41的六重PCR反●应体系，优化后的体系为HotstarTaqDNA聚合酶用量为1．25U／509l，镁离子的终浓度为3．5mM，dNTP的终浓度为400州，BSA(10mg／m1)的加入量为2“l，选取58℃为反应扩增的退火温度。利用优化的多重PCR体系进行荧光标记后与芯片杂交特异性地检测到转基因棉花中棉41中的外源基因启动子CaMV35S、终止子TNOS、报告基因NPTII和抗虫基因CrylAe。本论文建立了六重PCR偶联微流体芯片高通量检测转基因棉花的体系，为转基因植物的检测提供技术参考。棉花是适度耐盐的非盐生植物，但高浓度的盐离子仍会严重影响棉花的产量和棉纤维的品质。通过土地改良来改善日益加剧的土地盐碱化问题因效益和成本问题而搁置，因此通过转基因的方式提高作物的耐盐能力是目前解决土地盐碱化问题的有效方法。抗盐棉花的培育已成为棉花转基因研究领域的热点，需要建立相应的转基因检测技术以满足抗盐转基因棉花涌入市场的趋势，但棉花在盐胁迫下的分子调控机制还不是很透彻，因此深入研究棉花的耐盐调控机理为抗盐胁迫转基因棉花的培育提供候选基因。浙江理工大学硕士学位论文本论文开展了盐胁迫下苗期转基因棉花中棉41和中棉23的表达谱研究，对盐处理前后的棉花幼苗差异表达基因进行GO功能分析时发现，参与棉花胁迫应答的基因包括调控渗透胁迫的基因如脯氨酸合成酶基因、水通道蛋白基因、液泡ATP合成酶基因，调节离子平衡的基因如离子转运体基因、阳离子转运载体，抗氧化作用的酶基因及调控表达的转录因子家族。本论文综合探讨了盐胁迫下转基因棉花和非转基因棉花中发挥重要功能的基因，为棉花抗盐性转基因技术提供理论基础。关键词：转基因棉花；多重PCR：微流体芯片；盐胁迫；GO功能分析VII浙江理工大学硕士学位论文AbstractWiththeadvancementoftheindustrializationofgeneticallymodifiedcrops，moreandmoregeneticallymodifiedcropswereauthorizedintothefieldoffoodstuffandmedicineallovertheworld．Thus，thereisagreatchallengetopushauthoritiestoestablishafasteffectivedetectiontechnologyinordertomeetthehigh-throughputofdetectionrequirements．Inthispaper,allexogenousgenedetectionsystemofgeneticallymodifiedcottonwasestablishedbymultiplexPCRcoupled、Ⅳi也microfluidicchip．ThesystemcouldarnplificateheterologousgeneofgeneticallymodifiedcottonbymultiplePCRtechnologyinahighthroughputwayandusemierofluidicchipsforspecificdetection．Inourstudy，1032probesweredesignedwhichaccordingtotheexogenousgenesequenceofgeneticallymodifiedplantstheGMcropsdatabaseprovidedincludescreengene，specificgenes，construct-specificsequence，event-specificsequenceandreferencegene．TheoptimizationoftheconditionsisakeypointofmultiplexPCR．Inordertooptimizethemultiplex