奥沙利铂对人肝癌细胞周期调控相关机制分析-analysis on the mechanism of oxaliplatin regulating human hepatocellular carcinoma cell cycle.docxVIP

奥沙利铂对人肝癌细胞周期调控相关机制研究摘要目的：观察奥沙利铂（Oxaliplatin，L-OHP）对野生型肝癌细胞株HepG2、突变型肝癌细胞株HuH-7体外增殖和周期的影响，同时观察CyclinD1、CDK2、CDK4、p16、p21、p53表达的变化，为其应用于原发性肝细胞癌的临床治疗提供理论依据。方法：采用人肝癌细胞株HepG2、HuH-7作为研究对象，MTT法检测不同浓度和不同作用时间的L-OHP对细胞增殖的抑制效应；倒置显微镜观察L-OHP作用后细胞形态的改变；流式细胞术（FCM）检测L-OHP诱导HepG2、HuH-7细胞周期阻滞的作用；RT-PCR检测L-OHP作用后，细胞周期调节因子CyclinD1、CDK2、CDK4、p16、p21、p53在转录水平的表达变化；Westernblot方法观察L-OHP对CyclinD1、CDK2、CDK4、p16、p21、p53蛋白表达水平的影响。结果：1.MTT结果显示L-OHP对HepG2、HuH-7细胞增殖抑制率随药物浓度增加及作用时间延长有升高趋势，呈时间剂量依赖性。2.L-OHP作用后，细胞形态发生改变，细胞变圆、脱壁，并聚集成团。3.流式细胞术检测到L-OHP能够诱导HepG2、HuH-7细胞阻滞于细胞周期的S期，两种细胞S期细胞的比例均随浓度增加和时间延长而显著增多。4.L-OHP作用后HepG2、HuH-7细胞mRNA水平的表达改变：（1）L-OHP下调HepG2、HuH-7细胞CDK4和CyclinD1的表达。（2）L-OHP上调两种细胞p21的表达。（3）对两种细胞CDK2和p16表达均无明显改变。（4）对HepG2细胞L-OHP能上调p53表达，而对HuH-7细胞L-OHP低浓度上调p53表达而高浓度下调p53表达。5.L-OHP作用后，两种细胞蛋白表达水平与mRNA水平是一致的。结论：L-OHP能有效抑制人肝癌细胞的增殖并能够引起肝癌细胞阻滞于S期，其分子机制与CDK4、CyclinD1、p21及p53的表达变化有关。这些分子机制有助于我们进一步了解L-OHP的抗肝肿瘤活性，从而为L-OHP治疗肝癌提供实验基础。关键字：奥沙利铂，原发性肝细胞癌，细胞周期，流式细胞术，细胞周期调节因子AstudyontheeffectofoxaliplatinoncellcycleinhepatocellularcarcinomacelllineAbstractObjective:Toobservetheeffectsofoxaliplatin（L-OHP）onproliferationandcellcycleinhumanhepatocellularcarcinoma(GAN)celllinesHepG2(wild-typep53),HuH-7(mutated-typep53)invitro.TostudytheeffectsofL-OHPontheexpressionoffactorsincludingCyclinD1,CDK2,CDK4,p16,p21,p53,providingthetheoryfoundationthatusedforthechemotherapyofhepatocellularcarcinoma.Methods：InhibitoryeffectsofL-OHPontheproliferationofHepG2andHuH-7cellsweredeterminedbyMTTassay.Morphologicchangesunderlightmicroscopewereobservedbyinvertedmicroscope.Theeffectsofresveratrolonthecellcyclephasedistributionswereshownbyflowcytometry.ReversetranscriptionpolymerasechainreactionwasusedtodeterminethemRNAexpressionofCyclinD1,CDK2,CDK4,p16,p21,p53.Westernblotanalysiswasconductedtoexaminetheexpressionofthesetargetgenesattheproteinlevel.Results:1.MTTmethodrevealedthatL-OHPcouldinhibittheproliferationofhepatocellularcarcinomaHepG2andHuH-7cellsinadoseandtimedependentmanner.2.AfterL-OHPtreatment,cellsmorphologywerechanged:th