毕赤酵母中fld1启动子调控解脂耶氏酵母脂肪酶lip2表达的研究-study on the regulation of fld 1 promoter in pichia pastoris to lipolytic lipase lip 2 expression.docxVIP

摘要解脂耶氏酵母脂肪酶LIP2 (YlLIP2) 是一种高活力的脂肪酶，具有重要的工业应 用前景。本文克隆了甲醛脱氢酶启动子 (PFLD1)基因，并以pPICZαA质粒为基础构 建了带有PFLD1启动子和YlLIP2基因的重组质粒，电转化巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris) X-33获得重组表达菌株。摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组子，优化重组工 程菌的摇瓶发酵条件，同时在10 l发酵罐上对比了不同诱导策略对脂肪酶YlLIP2表达 的影响。主要研究内容和结果如下：(1) 通过 PCR 方法从 P. pastoris GS115/pPIC9K-Lip2-HIS+中扩增得到 PFLD1 基 因和脂肪酶 YlLIP2 基因。运用双酶切将 PFLD1 启动子替代 pPICZαA 表达载体上的 PAOX1 启动子，构建新的表达载体 pFZα，然后将脂肪酶 YlLIP2 基因插入该表达载 体，并电转化 P. pastoris X-33，得到重组菌 P. pastoris X-33/pFZα-Lip2。(2) 对重组子进行三次罗丹明 B 平板筛选，得到 308 个有橄榄油水解圈的重组子。 摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组子，得到一株最高活力达 672 U/ml 的 83#工程菌。 对 83#重组子进行了最适碳源和氮源筛选，以甲醇为碳源和诱导物，83#重组子在诱 导 72 h 后发酵液中