白血病抑制因子受体细胞内区结构与白血病细胞hl-60内分化 增殖信号的关系-relationship between intracellular region structure of leukemia inhibitory factor receptor and differentiation and proliferation signal in leukemia cell hl - 60.docxVIP

第二军医大学硕士学位论文ABBREVIATIoNSLIFleukemia inhibitory factorLIFRLIF receptorgpl90LIFRⅨsubunitgpl30IL一6 Related Signal Transducer(LIFRB subunit)JAKJanus kinaseSTATsignal transducer and activator oftranscription proteins FBSfetal bovine senlmDM[EMDulbecco’S modified Eagle’S mediumMAPKmitogen—activated protein kinaseMKKlmitogen-activated protein kinase kinase 1MKP．1mitogen—activated proteinkinase phosphatase 1oSMOncostation MCNTFciliary neurotrophic factorG．CSFRgranulocyte colony—stimulating factor receptor GFPgreen fluorescent proteinJ岫轴锄D印‘ofHittologymadF．m奶,ology，SecondMiiit=yM刮licalumwfd哪sh_Ⅱ曲Ii，2∞4332第二军医大学硕士学位论文白血病抑制因子受体细胞内区结构与白血病细胞 HL．60内分化、增殖信号的关系中文摘要}／l白血病抑制因子(Leukemia inhibitoryfactor,LIF)是一种多功能的细胞因子，它能够抑制白血病细胞，如HL．60、U937、M1等的增殖。LIF的 生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体完成的。LIF首先与LIF受体 a亚基(gpl90)结合，并使之与另一受体亚基D亚基(gpl30)结合形成异源性二聚体，从而启动细胞内信号转导使胞外的信号传入核内，调控特定基因的 表达，使细胞产生一系列的生理和病理变化。研究LIF的胞内信号转导对 了解LIF发挥生物学功能的分子机制有重要意义。在L[F抑制白血病细胞 的增殖的过程中，JAK．STATS通路是LIF产生活性的重要途径，而在众多 的STATS中STAT3的激活与白血病细胞的分化关系最为密切，LIF抑制白 血病细胞增殖与JAKI和STAT3的激活的关系也己被确定。有关LIF与有 丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p42／44的关系，在1994年被Schiemann证用做进一步的研究。研究LIF在白血病细胞的信号启动，对了解白血病细 胞的分化、增殖异常机理及其调控机制，为白血病的临床治疗提供基础理 论依据有重要意义。／本研究利用pAlter突变系统，通过基因重组技术将两受体亚基细胞内＼区互换构建了两个嵌合受体亚基基因130／190和190／130：130／190由gPl30的细胞外区、跨膜区和gPl90的细胞内区组成；190／130由gpl90的细胞外 区、跨膜区和gpl30的细胞内区组成。在此基础上，将130／190和190／130 装入真核表达载体pEDct，构建了表达载体pEDl30／190和pEDl90／130，并用Jiku如sh矗a,ocpt of删09yandEmla哼ology．s∞哪lMiliI_yMedicalUnilⅪn曲(轴_n曲■2∞433第二军医大学硕士学位论文脂质体转染法将其转入HL．60细胞内，并使之分别在HL．60细胞内成功表 达。在LIF的诱导下，HL．60细胞内形成受体亚基细胞内区同源性二聚体 190cyt一190cyt和130cyt一1 30cyt：转染pZDl30／190的HL一60细胞，在LIF的 诱导下，因存在数量上的优势，130／190取代HL．60细胞膜上的野生受体亚 基gpl30并同另一野生受体亚基gPl90一起与LIF结合，所以，受体复合 物的细胞外区仍由一个gpl30和一个gpl90组成，而细胞内区则由gpl90 的细胞内区同源性二聚体启动信号转导：同理，转染pEDl90／130的HL．60 细胞，则由gpl30细胞内区二聚体传递LIF的信号。通过检测同源性二聚体引发信号转导后的HL．60细胞内的JAKl磷酸化水平、S盯3磷酸化水平、MAPKp42／44磷酸化水平以及白血病细胞的增殖状况，观察gPl90和 gpl30亚基在LIF引发的信号转导中及其在自血病细胞增殖和分化中各起何 作用。首先，我们采用免疫沉淀的方法获得HL．60细胞内总JAKl蛋白，利用 磷酸化抗体通过免疫印迹杂交的方法检测了野生型、转染130／190、转染 190／130三组细胞LIF诱导前后的JAKl的磷酸化水平。结果显示：JAKl的 磷酸化