白藜芦醇通过stat3bmp信号通路调节星形胶质细胞活化促进脊髓损伤修复的研究-resveratrol regulates activation of astrocytes through stat 3 bmp signaling pathway to promote repair of spinal cord injury.docxVIP

目录一、摘要1(一)中文摘要1(二)英文摘要4二、正文7(一)前言(一)月U舌．．．1／(二)材料和方法10(三)结果26(四)讨论45(五)结论48(六)参考文献49三、综述．：．53(一)综述53(二)参考文献．60四、攻读学位期间发表文章情况63五、致谢64万方数据大连医科大学硕士学位论文白藜芦醇通过STAT3／BMP信号通路调节星形胶质细胞活化促进脊髓损伤修复的研究硕士生姓名：李萍指导教师：程晓馨副教授专业名称：细胞生物学摘要背景与目的：脊髓损伤(Spinalcordinjury，sci)，是一种严重的中枢神经系统疾病，还会引起一系列严重的并发症，不仅会给患者造成身体的伤残，甚至导致死亡。到目前为止，还尚未找到一种被大家所公认的有效的治疗方法。大量资料显示，药物治疗是目前被大家广泛接受的治疗手段，但是目前应用于临床的药物大多副作用严重，因此寻求更为有效的治疗药物，是脊髓损伤研究的前沿课题。脊髓损伤后，活化的星形胶质细胞和胶质瘢痕可改变受损部位的微环境，并分泌骨形态发生蛋白2(Bonemorphogeneticproteins2，BMP2)，抑制少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞，阻碍脊髓再生和修复。已有研究证实STAT3(SignalTransducerandActivatorsofTranscription3)通路激活是脊髓损伤后星形胶质细胞活化的必要条件。而在星形胶质细胞发育过程巾，BMP2是STAT3通路的下游靶基因。据此我们推测，脊髓损伤后星形胶质细胞中的STAT3被激活导致BMP2分泌增加。因此，抑制STAT3的活性可抑制星形胶质细胞的活化和增生，减少BMP2的分泌，进而促进少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞，最终有利于脊髓再生和功能的恢复。白藜芦醇广泛存在于天然植物中，具有多种有益的生物学活性，是STAT3的抑制剂。本文用白藜芦醇，通过抑制STAT3／BMP通路的活性，观察其对脊髓损伤修复的影响，为探讨脊髓再生修复的机制和寻找治疗脊髓损伤的新策略提供理论和实验依据。方法：应用脊髓损伤技术建立大鼠脊髓损伤模型；原代培养并纯化成年大鼠脊髓损伤的星形胶质细胞，建立星形胶质细胞活化的体外模型；用新生鼠的大脑纯化培养星形胶质细胞和神经元，建立神经元／星形胶质细胞混合培养体系。1)应万方数据大连医科大学硕士学位论文用细胞计数制作细胞生长曲线，结合免疫荧光染色、流式细胞术等，分析活化的星形胶质细胞的特性；2)应用MTT和流式细胞术等方法检测白藜芦醇对星形胶质细胞增殖的影响；3)应用Western．blot和免疫细胞化学等检测白藜芦醇对星形胶质细胞中GFAP、STAT3、P．STAT3、BMP2等蛋白表达的影响；4)应用RT-qPCR检测白藜芦醇处理前后GFAP、STAT3、BMP2在转录水平的变化情况：5)免疫荧光染色检测白藜芦醇对神经元轴突长度的影响；6)应，Hj高效液相色谱方法检测腹腔注射白藜芦醇后，正常鼠脊髓组织和损伤鼠脊髓组织吸收白藜芦醇的情况；7)应用BBB行为学检测不同的打击高度对鼠脊髓损伤程度的影响，以及评价白藜芦醇对脊髓损伤的大鼠运动功能恢复的作用；8)采用HE染色和免疫荧光检测白藜芦醇对脊髓损伤面积大小及组织中BMP2、STAT3、P．STAT3和NF—M等蛋白表达的影响。结果：1)与来源于正常脊髓的星形胶质细胞(NSCA)卡I比，源自损伤脊髓的星形胶质细胞(ISCA)的增殖能力变强，胶原纤维酸性蛋白GFAP和骨形成素蛋白BMP2均表达上调；2)白藜芦醇处理后，ISCA的增殖活性降低，并发生周期阻滞；3)ISCA中与STAT3／BMP通路相关的GFAP、STAI3、BMP2等在基因和蛋白表达水平上均表现为下调；4)白藜芦醇处理神经元／星形胶质细胞共培养体系后，神经元轴突的长度明显变长；5)腹腔注射白藜芦醇后，在正常脊髓组织(NSC)和损伤脊髓组织0SC)中均能检测到白藜芦醇；6)SCI．25mm组鼠的BBB行为学评分在术后7d即可达到20分左右，而SCI．50ram组鼠BBB行为学评分仅到11分左右；白藜芦醇治疗组的大鼠BBB行为学评分明显高于DMSO对照组和假手术组；7)白藜芦醇治疗组中脊髓损伤区域的损伤面积较DMSO对照组变小，治疗组损伤区域的BMP2、STAT3和P．STAT3等蛋白的表达明显下调，NF．M表达显著增强。结论：1)与SCI．25mm组比较，SCI．50mm组鼠脊髓损伤明显，所以SCI．50mm是适合制作脊髓损伤模型的打击高度；2)脊髓损伤后的星形胶质细胞增殖活性变强，GFAP和BMP2表达上调，细胞处于活化状态。表明ISCA是活化的星形胶质细胞，从而成功的建立了活化的星形胶质细胞体外模型；3)白藜芦醇对活化的星形胶质细胞具有抑制作用，主要表现在抑制细胞的增殖，降低GFAP和BMP2