白血病新融合基因pax5-ube2d4的克隆及功能分析-cloning and functional analysis of a new leukemia fusion gene pax 5 - ub2d4.docxVIP

白血病新融合基因 PAX5-UBE2D4 的克隆及功能研究中文摘要目的：1.检测 65 例初诊急性 B 淋巴细胞白血病及 19 例染色体核型分析为 9p13 异常患者中 PAX5 基因重排的发生率，并分析其临床特点及实验室特征。2.从一例伴 dic(7;9)(p11-13;p13)的混合表型急性白血病的研究入手，定位克隆 PAX5 的新对手基 因及融合基因，并对其新融合基因进行初步功能研究，以深化我们对 PAX5 相关融合 基因致白血病发生、发展机制的认识。3.分析 BCR/ABL1 阳性急性白血病中 BTG1 基因缺失的发生情况，阐述伴有 BTG1 基因缺失的 BCR/ABL1 阳性急性白血病的临 床及实验室特征, 初步探讨 BTG1 缺失与 BCR/ABL1 阳性急性白血病的发病及复发的 相关性。方法：1.通过 R 显带技术对 84 例患者骨髓标本进行核型分析，并选用位于 9p13 PAX5 基因两端的 RP11-344B23 和 RP11-652D9 克隆，常规抽提 DNA,采用缺口平移法标记 荧光素，应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）对 65 例 B-ALL 及 19 例伴有 abn(9p)异常的患者进行 PAX5 基因重排或缺失筛选，并分析其临床及实 验室特征。2.收集 7 例伴有 dic(7;9)的患者骨髓标本，其中 4 例应用 DNA 抽提试剂盒（Invitrogen 公司生产）抽提基因组 DNA，各自送检至少 1.5ug DNA 于上海伯豪生物 技术有限公司，选用安捷伦人类比较基因组芯片（Agligent Technologies,Santa Clara,CA,USA,244K）对 4 例患者进行 Array-CGH 技术检测，同时应用送检公司所提 供的软件（Agilent Genomic Workbench Lite Edition 6.5 software）进行数据与图像的分 析，明确 7 号和 9 号染色体的重排情况；利用 RT-PCR 验证易位中 PAX5 新对手基因（位于 7p13 的 UBE2D4 基因）；设计引物并利用 KOD 高保真酶扩增出 PAX5-UBE2D4 融合基因全长，根据后续功能研究的需要分别将 PAX5-UBE2D4 及 BCR/ABL 两个融 合基因全长克隆到慢病毒载体 LV5。采用慢病毒包装体系包装 PAX5-UBE2D4 及中文摘要白血病新融合基因 PAX5-UBE2D4 的克隆机功能研究BCR/ABL 病毒，并用病毒侵染 NIH-3T3 细胞及小鼠原 B 细胞 BaF3 细胞株，成功构建过表达 PAX5-UBE2D4、BCR/ABL、PAX5-UBE2D4+BCR/ABL 三种稳转细胞株， 通过 Western Blot 验证蛋白表达情况，绘制生长曲线、甲基纤维素集落形成实验、实 时定量 PCR 等情况观察这些对 NIH-3T3 及 BaF3 细胞的恶性转化能力。3. 收集 2001-2013 年期间在苏州大学附属第一医院住院诊断和治疗的 BCR/ABL1阳性急性白血病 44 例，选用安捷伦人类比较基因组芯片对 22 例患者进行 Array-CGH 技术检测，并对这 44 例患者的骨髓标本 mRNA，利用 RT-PCR 精确定位 BTG1 基因 缺失位点，并总结 BTG1 缺失组患者的临床及实验室特征，分析其与发病机制及复发 的相关性。结果：1.伴随 9p13/PAX5 重排患者的临床及实验室特征65 例 B-ALL 及 19 例 9p13 异常患者中 PAX5 基因缺失的有 20 例（23.8%），PAX5 基因易位的有 2 例（2.4%），PAX5 基因扩增 1 例（1.2%），总的异常率为 27.4%（23/84）。 伴有 t(9;22)的 PAX5 基因重排阳性率高于不伴有 t(9;22)的 PAX5 基因重排率，PAX5 基因重排在不同性别、年龄及不同白细胞、血红蛋白及血小板水平，差异均无统计学 差异（P 值均0.05）。PAX5-UBE2D4 融合基因的克隆及功能研究应用 FISH 技术、比较基因组杂交芯片、RT-PCR 和基因测序技术对其中 1 例患 者白血病细胞 dic(7;9)(p11-13;p13)的断裂点进行精确定位，克隆到一个新的累及 PAX5 和泛素结合酶 UBE2D4 的融合基因，PAX5-UBE2D4。该融合基因由 PAX5 的 1-7 号 外显子和 UBE2D4 的 2-7 号外显子融合而成，且 UBE2D4 基因的开放阅读框出现移 码后提前终止。通过分子克隆及细胞培养技术，利用携带 PAX5-UBE2D4 及 BCR/ABL 慢病毒载 体的质粒转染 NIH-3T3 细胞及 Ba