稗草c,4关键酶pepc ppdk基因的克隆及pepc基因对水稻和烟草的遗传转化-cloning of pepc ppdk gene, a key enzyme of barnyardgrass c, 4, and genetic transformation of pepc gene to rice and tobacco.docx

摘要利用基因_[程技术将Ct植物光合关键酶基因转入C3植物以提高其光台、水分和氮素的利用 效率已成为国内外研究的一个重要方向。稗属(Echinochloa)植物是稻田中典型的Ca型杂草，具 有适应性广、抗逆性强和生长势强等特点，至今对稗属植物有关C4关键酶的研究与利用仍属空白。 本研究以稗草(Echinochloa crusgalli)和家稗(Echinochloa,frumentacea)为材料克隆C4关键酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因，并对水、早稻和双子叶 植物烟草进行了遗传转化，取得了以下结果：首次从稗草和家稗中成功克隆了完整的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ppc eDNA)(基因登 录号为：AY251482，)和丙酮酸磷酸双激酶基因(Pdk eDNA)(基因登录号为：AY792619)，分别被命名为EcPpc和EfPdk。其核苷酸序列总长度分别为2886bp和2838bp，编码蛋白酶的氨基 酸残基数分别为961和945。同源与序列对比分析表明这两个基因分别为根型磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶基因和C。型丙酮酸磷酸双激酶基因。将稗草励c基因分别与强组成性表达的启动子Ubiquitin基因的启动子(p肋力、在叶组织 中受强光调控的特异性表达的特异性启动子1，5二磷酸核酮糖羧化酶基因(Rubiseo)小哑基基 因启动子(pRbcS)和玉米PEPC基因启动子(pZmp)融合分别构建了3个植物表达载体pUbi-Eppc、pP,bcS-Eppc、pZmp-Eppc。利用已构建的载体以及含有玉米完整的C4型PEPC核基因的表达载体pCB．ZMppc，通过农 杆菌介导法对水稻和烟草进行了遗传转化，筵获得转化水，早稻120株和烟草34铢。PCR扩增检测结果证明，多数植株都能扩增出目的基因Ppc和标记基因潮霉素磷酸转移酶基 因hpt)的预知目的片段，而对照植株都没有扩增产物。RT-PCR和Western杂交检测也得到了 相应证据。表明稗草Ppc基因已经整合到转基因水稻的基因组中并分别在mRNA和蛋白质水平得到了表达。对转PEPC基因水稻进行酶活和光台性能的铡定表明，转入稗草Ppe基因cDNA的水稻植抹， 绝大多数PEPC活性明显商于对照。最大为对照的8．07倍；转入玉米PEP(]基因的水稻的PEP(： 活性最大高于对照lo倍。初步表明转入完整的基因组DNA表达效果更好。PEPC活性比较结果 表明，转入早稻后PEPC的活性的增加幅度明显高于转入水稻的植株，本研究所获得的PEPC活性最高的植株均为早稻，初步证明向早稻内转入Ppc基因，更易得到较高的表达效率。光台性能 测定结果表明，转Ppc基因植株光台性能得到了综合改善。净光合速率与气孔导度、蒸腾速率表现正相关(相关系数分别为r2卸．5718、r匈．4267)。表明外源Ppc基因同时调节了水稻的羧化能力与气孔运动。而且过表达PEPC的水稻具有更高豹水分利用效率。 将稗草PEPC基因eDNA完整片段和玉米a特异的Ppc基因转入了双子叶植物烟草，结果表明稗草PEPC基因的eDNA完整片段能够在烟草中正确表达。而转入玉米C4特异的完整Ppc基因的烟 草叶绿体破坏严重，分化生长能力较差。可能是由于不正确的转录起始、终止，以及发生错误的 拼接，造成玉米C。特异的完整Ppc基因不能在烟草中很好的表达。证明种系发生的距离可能会妨 碍C‘植物基因在c3植物中的正常表达。 关键词：稗草，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，丙酮酸磷酸双激酶，基因克隆，水稻，烟草，光合效 率AbstractIt is a very important research field that C4 cycle key genes were transformed into Cs plants by gene engineering to improve their photosynthesis，water and N use efficiency．Echinochloa is a typical C4 weed that has wide adaptation,stress tolerance and growth in rice field However,its C4 cycle key genes have not been studied and transformed．In this study,the C4key enzymes genes of Echinochloa were isolated，sequenced and tranformed into monoc()tyledon rice and dicot37ledon tobacco，and the activities ofthe e