高氧对新生大鼠肺血管发育及肺组织sonic hedgehog信号通路的影响-effects of hyperoxia on pulmonary vascular development and sonic hedgehog signaling pathway in neonatal rats.docxVIP

一次性使用新生儿吊瓶输液器 上海麦得可医疗器械销售有限公司三、试剂多聚甲醛 国药集团化学试剂有限公司4%多聚甲醛 自行配置肝素钠 深圳市海普瑞药业有限公司生理盐水 深圳市海普瑞药业有限公司钡剂混悬液：钡剂(mg):水（ml)=4:3自行配置 4%多聚甲醛自行配置50%酒精 自行配置75%酒精，95%酒精 上海怡峰化工有限公司无水乙醇 常熟市杨园化工有限公司二甲苯 国药集团石蜡 上海长岛生物技术有限公司苏木素 上海长岛生物技术有限公司伊红 上海长岛生物技术有限公司中性树胶 上海长岛生物技术有限公司兔抗 CD31 单克隆抗体 上海欣临生物技术有限公司山羊血清 上海鼎国生物技术有限公司PBS 缓冲液（pH7.2～7.4）： 上海长岛生物技术有限公司柠檬酸三钠 上海长岛生物技术有限公司 0.5mol/L EDTA 缓冲液（pH8.0）： 上海长岛生物技术有限公司 Tris 碱 上海鼎国生物技术有限公司3%甲醇-H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80%甲醇溶液配制。自行配置 DAB 显色液上海长岛生物技术有限公司抗原修复液 上海海长岛生物技术有限公司四、试剂配备4%多聚甲醛：用 PBS 配置，55℃水浴过夜。五、方法1.新生大鼠干预：将出生6h 内的新生 SD 大鼠随机分成正常组和高氧组，每组8只，正常组老 鼠置空气培养，高氧组老鼠置85×50×20cm 有机玻璃密封箱内，予85%氧气 + 15% 氮气混合气灌流，3.5L/min,每24h 更换垫料及正常组高氧组母鼠互换（防止母 鼠氧中毒），食物和水按需供给。2.肺组织病理检测（1）、取肺组织：分别于 3d、7d、14d 将老鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，固定、开胸、放血、 摘心，结扎右主支气管，气管插管，4％多聚甲醛灌注左肺，维持压力 20cmH2O， 5min，取右肺－80℃保存备生化检测，左肺 4％多聚甲醛固定备做病理检测。 (2)、取 4％多聚甲醛固定 24h，50％酒精保存的肺组织，于酒精梯度脱水及二甲 苯透明，50％酒精：10min×1 次，75％酒精：10min×2 次，95％酒精：10min×2 次， 无水乙醇：8min×2 次， 50％无水乙醇＋50％二甲苯：8min×1 次， 二甲苯：8min×2 次。(3)、浸蜡包埋：取石蜡置烘箱 62℃融解，将脱水透明后的组织块浸蜡：30min×2 次， 将组织包埋于包埋盒中，烘箱中放置 10min 后取出室温冷却。(4)、将包好的蜡块－20℃放置 5min，用石蜡切片机 5μm 厚度切片， 45℃温水展片，载玻片捞片，室温晾干。(5)、烤片：将组织载玻片在 60℃恒温箱中烘烤 20 分钟。 (6)、脱蜡水化：将烘烤后的组织载玻片置于二甲苯中浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10分钟；无水乙醇中浸泡 5min，95%乙醇中浸泡 5min，75%乙醇中浸泡 5min，自来水 浸泡 2min，(7)、染色：苏木素染色 5min，自来水冲洗 3min， 伊红染色 5min，自来水洗 3min。(8)、脱水、透明： 75％酒精浸泡 3min，95％酒精浸泡 5min×2 次， 无水乙醇浸泡 10min×2 次 二甲苯浸泡 10min×2 次(9)、封片：中性树胶封片，室温晾干保存。 (10)、镜检：倒置纤维镜观察拍照。 (11)、病理照片形态学分析、计数、统计。肺泡计数：每组 6 个样本，每个样本 选一张切片，每张切片任选 10 个视野（200×），参照 Jakkula 等[5]的方法,计 数从呼吸性细支气管中心至最近纤维隔或胸膜直线上的肺胞数即 RAC 值，反映终 末呼吸单位含肺泡数的多少，衡量肺泡化程度。次级突起计数：每组 6 个样本，每个样本任选一张切片，每张切片任选不重叠的 10 个高倍视野（400×），取得每张切片 10 个高倍视野总的次级突起计数，最后取平均得每 10 个高倍视野的次 级突起计数值[24,25]。3、肺血管钡剂灌注(1)、分别于 3d、7d、14d 将老鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，固定、麻醉后迅速 开胸，向右心室注入 500u 肝素。 (2)、气管插管使肺保持通气状态，将左心耳剪开一小缺口，用肝素化生理盐水（1U/ml）通过肺主动脉快速冲洗肺血管内血液，直到肺不再变白。 (3)、将钡剂混合物通过肺主动脉注入肺循环，压力为 73mmHg,持续 3-4 分钟， 直到肺表面有钡剂渗出。(4)、右左支气管注入 4%多聚甲醛直至肺尖膨胀，取右肺，置于 4%多聚甲醛固定 液中 4℃过夜，常规石蜡包埋切片，并行 HE 染色，光镜下计数 10 个不同视野的钡剂密度以其均值代表血管数量。左肺直接置于 4%多聚甲醛