Twist、VEGF在非小细胞肺癌患者.pptxVIP

Twist、VEGF在非小细胞肺癌患者组织及血清中的表达及临床意义 答辩人 张凌指导教师 程德云教授目 录1材料与方法2结果53讨论4结论研究背景和意义一、研究背景和意义 肺癌是是最常见的恶性肿瘤之一，其在癌症死因中位居前列，大致占癌症总死亡人数的29％ 非小细胞型肺癌患者（NSCLC）约占所有肺癌患者的80% 进展期肺癌的5年生存率仅15% 多数患者就诊时已发生了转移，极大影响了治疗的效果 为找到防治肺癌的多种可行途径，有大量实验研究肺癌发生、浸润以及转移的分子机制肺癌的发生、发展与许多癌基因的激活、抑癌基因的失活有关一、研究背景和意义Twist基因在诱导细胞移动和组织塑形中具有重要作用其通过促进上皮-间质转变(EMT)在胚胎发育中起关键调控作用新的研究表明：Twist能编码凋亡抑制蛋白，是一种新的癌基因，其可通过p53依赖与非依赖的通路参与细胞凋亡的调控。恶性程度高、浸润性强的肿瘤亚型中均可见Twist过度表达恶性程度较低的癌细胞和正常组织中低表达或无表达现代肿瘤学认为：肿瘤的生长、侵润、转移须依赖肿瘤血管的生长VEGF是当前已知的促血管生成作用最强的生长因子促进肿瘤血管内皮细胞的增生和迁移等增加血管通透性，引起纤维蛋白、血浆蛋白及液体外渗，导致细胞外基质发生变化，从而促进血管生成一、研究背景和意义Twist在肺癌患者血中的表达，以及血中与组织中表达的相关性尚无相同文献报道 本研究探讨Twist、VEGF在NSCLC发生、发展中的作用及其与NSCLC血管生成和转移之间的关系，为NSCLC的防治提供新的策略Twist、VEGF在NSCLC患者组织、血中的表达Twist在NSCLC患者血中表达和各临床病理特征的关系Twist、VEGF在NSCLC患者组织与血中表达的相关性血清中Twist、VEGF的表达对NSCLC的诊断评价二、材料与方法1、研究对象2007年1月-2013年5月在成都市第二人民医院就诊的NSCLC患者和肺良性病变患者二、材料与方法NSCLC患者排除标准：纳入标准：A、术前经肿瘤化疗及放疗者B、肝、肾功异常者C、合并其他肿瘤者A、肺癌，经病理学检查确诊者B、所有病例均常规作临床分期检查，包括X线正、侧位胸片、头颅及胸腹CT等。临床分期均采用1997年世界抗癌联盟分期标准分期。二、材料与方法1）一般情况 手术切除并经病理确诊为NSCLC患者64例，并以肺良性病变患者30例为对照。（两者在年龄上无统计学差异）NSCLC患者 ：平均年龄64.8±7.2 岁男性33例，女性31例肺良性病变患者：平均年龄62.1±6.5 岁男性17例，女性13例二、材料与方法2) NSCLC患者临床病理特征：病理类型： 鳞癌24例，腺癌40例临床分期： I-II期18例，III期46例有无淋巴结转移： 有转移38例，无转移26例分化程度： 低+中分化55例，高分化9例3) 肺良性病变患者样本病理及血清标本： 20例（炎性假瘤13例，肺结核7例）仅血清标本： 10例（慢性阻塞性肺疾病6例，细菌性肺炎4例）二、材料与方法2、样本的采集 术前早晨空腹采静脉血5ml1000g 4℃离心10分钟，分离血清与血细胞血清分装到1.5mlEP管中，-70℃保存备用术后收集患者匹配的病理组织标本，使用10％的福尔马林液固定组织标本经石蜡包埋处理后，用切片机切成4um厚连续切片一张做苏木精-伊红染色，余切片采用EnVision两步法作免疫组化二、材料与方法4、主要仪器石蜡切片机恒温箱恒温水浴箱 高压消毒锅 微波炉光学显微镜 微量移液器 酶标仪低温冷冻离心机BX51图像采集系统3、试剂APES防脱片胶兔抗人Twist多克隆抗体兔抗人VEGF多克隆抗体ChemMateTM EnVision检测试剂PBS溶液 Twist试剂盒 VEGF试剂盒 二、材料与方法5、检测方法免疫组化 血清ELISA检测 5.1 免疫组化免疫组化：测定组织中Twist和VEGF水平采用EnVision两步法进行检测：1. 手术病理标本使用浓度为10％的福尔马林液体固定2. 石蜡包埋处理，连续切片，一张做苏木精-伊红染色，余切片作免疫组化5.1 免疫组化1. 常规脱蜡水化8. 苏木素复染，蒸馏水漂洗9.脱水、透明2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡7. 滴加色源底物溶液DAB，光镜控制显色，蒸馏水漂洗10.中性树胶封片后镜检3. H2O2阻断内源性过氧化物酶,孵育，蒸馏水漂洗，PBS浸泡6. 滴加EnVisionTM 孵育，PBS漂洗4.PH8Tris-EDTA抗原修复液水浴修复，PBS冲洗5. 滴加抗Twist抗体及抗VEGF抗体，孵育， PBS漂洗5.2血清ELISA检测 ELISA法：测定血清中Twist(ng/ml)、VEGF(pg/ml)水平1.设定标准孔、空白孔和待测样品孔