骨碎补干预骨髓间充质干细胞对兔关节软骨修复的实验分析-experimental analysis of drynaria fortunei intervening bone marrow mesenchymal stem cells in repairing rabbit articular cartilage.docxVIP

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2018-07-05 发布于上海
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骨碎补干预骨髓间充质干细胞对兔关节软骨修复的实验分析-experimental analysis of drynaria fortunei intervening bone marrow mesenchymal stem cells in repairing rabbit articular cartilage

骨碎补骨碎补干预骨髓间充质干细胞对兔关节软骨修复的实验研究 PAGE PAGE 10中文摘要目的：1.骨碎补干预骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导。2. 观测兔软骨细胞-FN/PLGA/TGF-β1 生物支架复合体对兔膝关节软骨缺损修复的实验研究。方法：1.进行兔骨髓间充质干细胞的体外培养，通过形态学观察、FCM 检测及甲苯胺蓝染色进行鉴定；2. 最佳浓度骨碎补干预兔 BMSCs 向软骨细胞转化，通过 MTT 法对细胞活性的检测、免疫组化对Ⅱ型胶原的测定及甲苯胺蓝染色检测 GAG 的合成等方法观察体外培养的兔 BMSCs 增殖分化的情况，并以此得到软骨细胞；3. 将聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)生物支架切成 4mm*4mm*4mm 大小，消毒，将诱导好的第 2 代软骨细胞以 4×1010/L 体外接种于 PLGA 生物支架上，体外培养 7 天，观察细胞在支架内的生长情况、形态及吸附、分布情况;行 HE 染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察软骨细胞数量、形态及Ⅱ型胶原含量，并利用图像分析软件对Ⅱ型胶原免疫组化染色面积进行分析。 4. 将细胞-支架复合物植入兔膝关节软骨缺损处，分别在 4 周，8 周，12 周取样，观察细胞-支架复合物对软骨缺损的修复情况。结果：1.①兔 BMSCs 成均匀分布的簇状生长、形态梭形。在传代培养中形态特性无明显变化、均质性提高，高表达 CD44，不表达 CD34，可证明为非造血干细胞。②骨碎补可以诱导兔 BMSCs 向软骨细胞分化，诱导后的细胞能分泌细胞外基质，例如Ⅱ型胶原蛋白，用组织学检查及Ⅱ型胶原抗体免疫荧光检测证实骨髓间充质干细胞已转化为软骨细胞。2.① HE 染色对照组支架纤维组织有所增加，未见成软骨细胞和软骨组织，支架被少许骨基质及纤维组织填充;试验组支架降解成网状并被吸收，成软骨区圆形、椭圆形、多边形成软骨细胞及细胞间质逐渐增多，生成少量软骨组织，并见少量多核的破骨细胞及软骨基质；空白组仅见少量淋巴细胞和纤维细胞，未见软骨细胞。②Ⅱ型胶原染色细胞支架组软骨区域 PLGA 生物支架逐渐降解减少，Ⅱ型胶原染色阳性逐渐增强，类软骨样组织逐渐增多，术后 12 周后可见少许类软骨样组织；对照组和空白组术后Ⅱ型胶原染色均为阴性；③甲苯胺蓝染色细胞支架组术后 4 至 8 周甲苯胺蓝染色阳性逐渐增强，细胞核外类软骨样组织逐渐增多，术后 12 周有类软骨样组织生成；对照组和空白组各检测周期甲苯胺蓝染色阴性 3.电镜扫描细胞支架组成软骨区可见大量圆形、椭圆形软骨细胞；对照组扫描电镜下表面较粗糙，孔隙较多，大小不一，孔隙间多有交通，未发现软骨细胞；空白组电镜下未发现软骨细胞生成。结论：1.通过体外对兔 BMSCs 的分离培养与鉴定，可建立较完善的 BMSCs 培养体系；骨碎补各组与阳性对照组相比诱导作用弱，但与空白组比较有阳性意义。2.纤维粘连蛋白修饰的 PLGA 支架具有良好的亲水性，更适合软骨细胞贴附生长以及Ⅱ型胶原的合成;3.软骨细胞-FN/PLGA/TGF-β1 复合体修复软骨缺损具有可行性，在软骨组织缺损修复中具有较大的应用前景。关键词：BMSCs；诱导；骨碎补；PLGA；FN；组织工程ABSTRACTPurpose: 1. Drynaria fortunei intervention of bone marrow stromal cells induced stem cells to cartilage. 2. Observation rabbit cartilage cells-FN/PLGA/TGF-β 1 biological stents to complex the rabbit knee cartilage defect of experiments.Methods: 1. Conduct rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in vitro culture, through the morphological observation, FCM detection and a blue staining aniline identification; 2. The best concentration drynaria fortunei intervention BMSCs rabbit to cartilage cells transformed through MTT method for detection of cell activity and immunohistochemicaldetermination of the Ⅱ of collagen type and armour