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生血宁片指纹图谱研究 　　[摘要] 建立中药制剂生血宁片指纹图谱研究方法。以二氢卟吩e6（chlorin e6）为对照品，采用SHISEIDO Capcell-pak C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.2%甲酸溶液[含20 mmol·L-1四丁基溴化铵（TBAB）]为流动相A，乙腈-甲醇-丙酮（50∶50∶5）为流动相B，梯度洗脱，检测波长392 nm，流速1.0 mL·min1，柱温45 ℃。指纹图谱共标定10个共有峰，各共有峰相对保留值变化的RSD均在0.50%之内，采用UPLC/DAD/Q-TOF-MS xevo G2 Q-Tof LC/MS初步归属了其中6个色谱峰。生血宁片中主要含叶绿素的铁代衍生物，主要成分是铁二氢卟吩p6，铁二氢卟吩e6，铁异二氢卟吩e4等。 　　[关键词] 生血宁片；指纹图谱；UPLC/DAD/Q-TOF-MS 　　生血宁片是蚕砂提取物制成的薄膜衣片，是我国批准的治疗贫血的唯一中药二类新药，用于治疗气血两虚型缺铁性贫血，疗效与传统铁剂福乃德相似，且无传统铁剂常见的不良反应[1]。蚕砂中提取的叶绿素化学结构是由4个吡咯环组成的卟啉环，与血红蛋白结构及其相似。文献报道从蚕砂中合成的一系列二氢卟吩金属络合物，对辐射引起的再生障碍性贫血具有治疗作用[2-3]。 　　蚕砂提取物是以蚕砂为原料，首先以丙酮抽提叶绿素，然后经皂化、酸析、铁代、成盐而成。由于具体有效成分不明确，原蚕砂提取物以及生血宁片标准仅以酸碱滴定法测定总叶绿素衍生物的含量，且总量以铁叶绿酸b（C34H30O6N4Fe）计。 　　本试验采用HPLC-UV对生血宁片的特征指纹图谱进行了研究，得到了分离度及重复性均较好的片剂特征指纹图谱，并利用UPLC/DAD/Q-TOF-MS技术对其主要色谱峰进行了初步归属，为更好地控制生血宁片的质量提供了可靠依据。 　　1 材料 　　Waters e2695型高效液相色谱仪；AcquityTM UPLC，Waters xevo G2 Q-Tof液质联用仪，Waters 2998 Photodiode Array Detector；Waters 2489UV/Visible Detector；Dionex P680 PDA-100高效液相色谱仪；Agilent 1100型色谱仪；Waters AcquityTM超高效液相系统，Waters XevoTM Q-TOF-MS系统；BS210S型电子天平（德国Sartorius公司）；超声仪。 　　二氢卟吩e6对照品（chlorin e6，Frontier Scientific，纯度95%， Batch VY08-595）。生血宁片（批20100202201002042010020620100302由武汉联合药业有限责任公司提供。乙腈为色谱纯（美国TEDIA公司），纯净水为Milli-Q纯水，其余所用试剂均为分析纯。 　　蚕砂对照提取物的制备：取蚕砂400 kg，用水充分润透，用蚕砂2倍量的丙酮回流提取3次，取丙酮提取液常压蒸馏回收丙酮得墨绿色糊状叶绿素（叶绿素质量分数大于10%，吸光比2·4H2O，加热保持微沸2.5 h至溶液呈深绿色为止，得铁代产物。取铁代产物用蒸馏水洗至无游离铁离子（用邻氮二菲试剂检测洗涤液），然后加入铁代产物0.2倍量的30%氢氧化钠溶液，使成钠盐，钠盐加水使成50%的溶液，再加丙酮至丙酮质量分数为80%，得沉淀，干燥，得蚕砂提取物1 000 g。该提取物含叶绿素衍生物为70.0%～80.0%；含铁叶绿酸钠以铁二氢卟吩e6钠（C34H31N4O6FeNa3）计，为40.0%～50.0%。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件 　　（Ⅰ）SHISEIDO Capcell-pak C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），（Ⅱ）Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），（Ⅲ）Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为0.2%甲酸溶液（含20 mmol·L-1四丁基溴化铵），流动相B为乙腈-甲醇-丙酮50∶50∶5，流速1 mL·min1；检测波长392 nm；柱温45 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱条件见表1。 　　2.2 样品溶液的制备 　　2.2.1 参照物溶液的制备 精密称取Chlorin e6对照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，密塞，超声处理（250 W，33 kHz）10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。 　　2.2