高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中聚合物含量.docVIP

高效液相色谱法测定头孢地尼及制剂中聚合物含量 　　摘要：目的 采用聚苯乙烯高效液相色谱法检查头孢地尼中聚合物的方法。方法 色谱柱为聚苯乙烯凝胶为填料的TSKgel G2000SWxl（7.8 mm×300 mm 5um）色谱柱，流动相为0.1 mol/L，pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5），流速为0.5 mL/min，检测波长285 nm，通过HPLC-ESI-MS法鉴定高分子杂质峰，并对其结构进行推定。结果 头孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好线性关系（r=1.0000）最小检测浓度为0.2 ug/mL，聚合物杂质与头孢地尼能有效分离，并先于主峰流出，方法专属性良好，样品在溶液中不稳定，需临用新配。结论 建立的方法快速准确。适用于头孢地尼及其聚合物的测定。 　　关键词：高效液相色谱；聚苯乙烯凝胶；头孢地尼；聚合物；β-内酰胺类抗生素；过敏原 　　头孢地尼为半合成的第三代口服头孢菌素，属于β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、疗效高、毒性低等特点。β-内酰胺抗生素是目前临床上最常用的抗感染药物[1]。研究证明，引发过敏反应的过敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子杂质，因此国内外对β-内酰胺类抗生素的高分子杂质的控制非常重视。2010版中国药典已有22个品种43个标准的控制[2]。 　　中国药典2010年版已采用葡聚糖G-10自身对照外标法对大部份常用注射用头孢类抗生素进行了高分子杂质控制，也有文献报道使用葡聚糖G-10用于头孢地尼聚合物的测量[3]。葡聚糖G-10可以手工填装，也有商品化色谱柱，使用该填料的分离的色谱峰拖尾严重，不利于该产品聚合物的测定。日本药典（JP）对头孢卡品酯采用以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基础的TSKgel G2000 色谱柱进行聚合物控制。也有文献报道使用国产的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基础的，以分子排阻为主要分离机制，用于测定头孢呋辛酯中高分子聚合物的检查[4]。 　　因此我们采用苯乙烯为填料的TSKgel G2000SWxl色谱柱。 　　1仪器与试药 　　液相色谱仪，检测器： Waters2998，溶液输送泵：Waters2695，柱温箱：Waters Corporation工作站：Empower版本6.20。 　　2色谱条件 　　色谱柱，TOSOH TSKgel G2000SWxl （300mm）；柱温：35℃恒温。流速：0.5 mL/min。 　　3溶液的制备 　　3.1对照品溶液的制备 取头孢地尼对照品适量，精密称定，用0.1 mol/L pH=7.0缓冲液制成含头孢地尼对0.01 mg/mL的溶液。 　　3.2供试品溶液的制备 取样约品10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L pH=7.0缓冲液稀释至刻度摇匀。 　　4色谱条件的选择与优化 　　4.1流动相组成的选择 去头孢地尼对照品适量，精密称定，用pH=7.0缓冲溶液稀释成1 mg/mL的溶液，在25℃放置48 h，精密量取10 μL，分别用表1中的四种流动相进行分析，色谱图如图所示，用头孢地尼主成分与其检出杂质、分离度、峰面积及总分析时间为分析指标，发现上述五种色谱系统中，0.1 mol/L pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5），作为流动相时，各项指标最优，故选用0.1 mol/L pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5）作为流动相，见图1。 　　4.2流速的影响 在0.1 mol/L pH=7.0缓冲溶液-甲醇（95∶5）色谱系统中，考察选流速对色谱分离的影响，结果显示流速为1.0ml/min时，杂质峰与主成分峰不能有效分离，当流速降为0.5 mL/min时，各峰的分离度良好，杂质峰的保留时间为22.067 min主峰流出在25.010 min之后，在30 min内，完成一个样品分析，典型的色谱图，见图2。 　　4.3柱温的影响 取供试品溶液按2.1项下的方法，分别在25℃、35℃、50℃下进行测定，结果在35℃时主成分与杂质锋的分离效果和对称性最优。 　　5专属性考察 　　5.1聚合物的结构鉴定 采用LC-ESI-MS法，测定系统适用性考察用溶液中高分子聚合物的分子量，通过对待测样品LC分析，样品中有少量杂质峰，根据相关文件报道，猜测其是头孢地尼的低聚物。对强度较大的813.0，791.0，828.9峰分析，它们分别对应与二聚加钠峰，二聚加钾峰，见图3。 　　5.2强力破坏样品中聚合物的分离 取本品原料适量，分别经强酸（0.1 mol/L HCl）沸水浴，强碱（0.1 mol/L NaOH）沸水浴， 过氧化氢沸水浴，加热破坏处理，光照，综合后分别用流动相稀释成0.2 mg/mL的供试品溶液。取10 uL按上述色谱条件进行分离。结果表明，在上述色谱系统下，各种破坏试验均能使聚合物